白果总黄酮超声波提取及抗衰老作用

李树立 郝秋娟 赵士豪 张瑞平

(河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061)

白果总黄酮超声波提取及抗衰老作用

李树立 郝秋娟 赵士豪 张瑞平

(河北经贸大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050061)

目的 探讨确立白果总黄酮最佳提取方法并研究其抗衰老活性。方法 选取4个品种的白果：佛手、佛指、金坠、圆铃，采用正交法确立总黄酮最佳超声波提取工艺，并通过芦丁标准曲线测定提取物中的总黄酮含量；采用光度计比色法测定4个品种白果总黄酮提取物的清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基，清除超氧阴离子自由基，清除2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的能力以及还原能力。结果 白果总黄酮超声波提取最佳工艺为：时间50 min、温度80℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶15；4种白果总黄酮含量均较高，其中由高到低依次为：佛指>金坠>佛手>圆铃。抗衰老作用研究显示，佛指清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基和还原能力最强，其次为圆铃，两者均优于佛手、金坠；且4种白果总黄酮均在质量浓度400 μg/ml时达到较高水平，之后进入平台期。结论 白果总黄酮具有较好的抗衰老作用，其中以佛指总黄酮效果最佳。

白果；总黄酮；抗衰老；抗氧化

白果为银杏的种仁，含有蛋白质、糖类、胡萝卜素、矿物元素、银杏酸、黄酮等成分。其中黄酮类化合物为白果重要的功能成分，具有抗炎、抗感染、抗衰老等生物活性〔1〕。自由基为机体氧化反应生成的有害物质，有强氧化性，能够通过损伤机体组织和细胞，引起人体的慢性疾病和衰老效应。采用黄酮类化合物来清除人体内的自由基，进而对抗衰老是近年来研究热点之一。目前，国内外对银杏黄酮抗氧化和衰老的研究较多，但对白果黄酮类化合物相关研究较少〔2〕。本次研究对白果总黄酮的提取方法和不同品种白果总黄酮的抗衰老作用进行初步研究，旨在为白果作为天然抗氧化及衰老功能性食品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂 4个品种的白果：佛手、佛指、金坠、圆铃，均购于石家庄市天客隆农贸市场；无水乙醇、氢氧化钠、三氯乙酸等试剂均为分析纯，购于天津市北方天医化学试剂厂；芦丁标准品购于中国药品生物制品检定所，批号0080-9705；二苯基苦基苯肼(DPPH)、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)购于美国Sigma公司。

1.2 仪器 旋转蒸发仪(上海亚荣RE52-99型)；电子分析天平(瑞士梅特勒AL204-IC 型)；水循环真空泵(上海亚荣X-5型)；紫外可见分光光度仪(岛津UV-2550)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司 JY98-3D型)；中药粉碎机(济南达微机械有限公司)；鼓风干燥箱(丹东瓦德科技有限公司)；电热恒温水浴锅(北京长安科学仪器厂)。

1.3 白果总黄酮提取与测定

1.3.1 标准曲线绘制 采用紫外分光光度法绘制芦丁标准曲线，首先取芦丁标准试剂干燥至恒重，用30%乙醇配成不同浓度的芦丁溶液，加入0.5 mol/L的NaNO2溶液1.0 ml摇匀，放置10 min，加入1.0 mol/L的Al(NO3)3溶液1.0 ml摇匀，放置10 min，再加入0.4 mol/L的NaOH溶液10.0 ml，加水定容至刻度，摇匀，10 min后以空白试剂为参比，测定510 nm波长处的吸光度，得到芦丁标准曲线。

1.3.2 白果总黄酮提取 将4个品种的白果剥皮，取果肉至于80℃烘箱中48 h后粉碎，过40目筛。取20 g放入500 ml的三角瓶中，加入80%的乙醇溶液300 ml，80℃下超声提取50 min，连续提取滤渣2次，最后将收集到的提取液合并，用旋转蒸发仪浓缩后用80%的乙醇溶液定容至100 ml，使用紫外可见分光光度仪在510 nm处测定吸光度，带入标准曲线计算总黄酮含量，所有样本均测试3次。

1.3.3 白果总黄酮正交实验 在单因素实验基础上采用正交实验优化提取工艺，实验因素包括提取时间、提取温度、乙醇体积、料液比，选用L9(34)正交设计表进行实验。正交实验因素水平见表1。

表1 白果总黄酮提取正交实验因素水平

1.4 白果总黄酮抗衰老测定测定

1.4.1 清除DPPH自由基测定 配制不同质量浓度的白果总黄酮提取液，分别取4 ml加入4 ml的DPPH溶液(0.1 mmol/L，溶剂为无水乙醇)，混匀，置于黑暗环境中反应40 min，在517 nm处测定吸光度，样品均测定3次。DPPH清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1)〕×100%。其中A为样品与DPPH溶液混合后的吸光度；A0为样品本身的吸光度；A1为DPPH溶液吸光度。

1.4.2 清除超氧阴离子自由基测定 采用邻苯三酚自氧化法测定：向比色管中加入1 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)5 ml，26℃条件下水浴30 min，分别加入0.5 ml不同浓度的4种白果总黄酮提取液及3.0 mmol/L的邻苯三酚0.9 ml，混匀，26℃水浴反应5 min，立即加入3滴10 mmol/L的HCl终止反应，在310 nm处测定吸光度。超氧阴离子清除率(%)=〔1-(A1-A2)/A0〕×100%。其中A1为只加邻苯三酚的吸光度；A2为样品与邻苯三酚的吸光度；A0为只加样品的吸光度。

1.4.3 清除ABTS自由基测定 将8 mmol/L的ABTS溶液20 ml和280 mmol/L的高锰酸钾溶液0.4 ml混匀，黑暗环境中静置16 h，制得ABTS自由基溶液，配置成不同质量浓度的备用液。分别将四种白果总黄酮提取液2 ml、ABTS自由基溶液4 ml、蒸馏水2 ml依次加入试管中，在黑暗环境中反应40 min，之后在740 nm处测定吸光度，样品均测定3次。ABTS清除率(%)=〔1-(A-A0)/A1〕×100%。其中A为样品与ABTS溶液混合后的吸光度；A0为样品本身的吸光度；A1为ABTS溶液吸光度。

1.4.4 还原能力测定 采用普鲁士法测定：将2 ml不同浓度的总黄酮提取液与5.0 ml的0.3 mmol/L磷酸缓冲液、5.0 ml的1%铁氰化钾混匀，40℃条件下水浴30 min，再加入10%三氯乙酸5.0 ml，混匀后在4 000 r/min条件下离心20 min，取上清液10 ml与同体积的蒸馏水混合，再加入0.1%三氯化铁2 ml，在740 nm处测定吸光度，测量值越高说明还原能力越强。

2 结 果

2.1 白果总黄酮含量 以芦丁质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作标准曲线，得到方程A=2.176 0C+0.010 5，R2=0.999 5。根据标准曲线方程，采用外标法测得佛手、佛指、金坠、圆铃样品总黄酮含量依次为0.089%、0.174%、0.136%、0.081%。其中佛指总黄酮含量最高，圆铃最低。

2.2 白果总黄酮提取正交实验 四个因素中对黄酮提取的影响程度为C>A>B>D。可初步确定白果总黄酮提取的最佳工艺条件为A3B2C3D2，即提取时间50 min、提取温度80℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶15。见表2。

2.3 白果总黄酮对DPPH自由基的清除 四种白果总黄酮质量浓度在50～350 μg/ml范围内，对DPPH自由基清除率随浓度增加而显著增强，当质量浓度超过350 μg/ml时，清除率趋于平稳。四种白果总黄酮对DPPH自由基的清除能力：佛指>圆铃>金坠>佛手。见图1。

2.4 白果总黄酮对超氧阴离子自由基的清除 佛指总黄酮质量浓度在50～300 μg/ml范围内，对超氧阴离子自由基清除率随浓度增加而显著增强，当质量浓度超过300 μg/ml时，清除率趋于平稳。金坠、佛手、圆铃总黄酮质量浓度在50～450 μg/ml范围内，对超氧阴离子自由基清除率随浓度增加而显著增强，当质量浓度超过450 μg/ml时，清除率趋于平稳。佛总黄酮指对超氧阴离子自由基的清除能力优于金坠、佛手、圆铃。见图2。

表2 白果总黄酮提取正交实验结果

图1 4种白果总黄酮对DPPH自由基的清除作用

图2 4种白果总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用

2.5 白果总黄酮对ABTS的清除 4种白果总黄酮质量浓度在50～400 μg/ml范围内，对ABTS的清除率随浓度增加而显著增强，当质量浓度超过400 μg/ml时，清除率趋于平稳。当浓度在50～200 μg/ml范围内时4种白果总黄酮对ABTS的清除率相似；>200 μg/ml时，佛指和圆铃对ABTS的清除率较强。见图3。

图3 4种白果总黄酮对ABTS的清除作用

2.6 白果总黄酮的还原力 4种白果总黄酮质量浓度在50～400 μg/ml范围内，还原力随浓度增加而显著增强，且佛指的还原力最强；>400 μg/ml后，4种白果总黄酮的还原力逐渐平稳，且无明显差异。见图4。

图4 四种白果总黄酮的还原力

3 讨 论

人体细胞的氧化还原代谢过程中，部分氧原子未能得到充分的电子而无法与氢原子完全结合，进而产生了氧自由基，过剩的氧自由基会作用于组织、细胞等脂类物质，导致其生成脂质过氧化物，沉积于细胞膜上导致细胞活性降低，机体组织器官功能衰退，进入衰老状态，因此抗氧自由基在对抗衰老中具有重要意义〔3〕。目前研究认为，导致人体衰老的主要自由基包括DPPH自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基〔4〕。本研究提示今后对白果总黄酮研究中应首选佛指总黄酮，并可对质量浓度为400 μg/ml的白果总黄酮进行相关抗衰老动物或细胞学实验，进一步探讨其抗衰老活性。

1 才 真.天然药物抗氧化、抗衰老的研究进展〔J〕.医学综述，2014；20(16)：2994-5.

2 李素云，王立芹，郑稼琳，等.自由基与衰老的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2007；27(20)：2046-8.

3 赵燕燕，刘新霞，陈春生，等.机体衰老时体内指标变化〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(19)：2855-7.

4 张 岳，余 瑾，张 艺，等.衰老可导致间充质干细胞氧化损伤修复能力降低〔J〕.中国组织工程研究，2013；17(10)：1801-8.

〔2014-10-19修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

河北省科技计划项目(No.10237101D-9)

李树立(1963-)，女，硕士，副教授，主要从事生物工程、生物活性物质提取研究。

R28

A

1005-9202(2015)12-3252-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.029