解旋酶RECQ1和细胞核相关抗原 Ki-67在脑胶质瘤组织中的表达及相关性

2015-06-12郭成永梁朝辉魏可欣孙国柱焦保华赵宗茂

中国老年学杂志 2015年12期

关键词：阳性细胞胶质瘤神经外科

郭成永梁朝辉魏可欣孙国柱焦保华赵宗茂

(保定市第一医院神经外科，河北保定 071000)

解旋酶RECQ1和细胞核相关抗原 Ki-67在脑胶质瘤组织中的表达及相关性

郭成永梁朝辉魏可欣1孙国柱焦保华赵宗茂

(保定市第一医院神经外科，河北保定 071000)

目的分析解旋酶RECQ1和细胞核相关抗原 Ki-67在脑胶质瘤组织中的表达及其相关性。方法选取该院神经外科收治的脑胶质瘤手术治疗患者80例，根据病理学分级分为Ⅰ～Ⅱ级44例，Ⅲ～Ⅳ级36例，另外选取正常脑组织20例，利用免疫组化法检测RECQ1、Ki-67的表达情况，计算RECQ1、Ki-67表达的相关性。结果 ①RECQ1、Ki-67在正常脑组织中表达呈阴性，在胶质瘤组织表达呈阳性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织中多为低表达，在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中多为高表达；②RECQ1在正常脑组织中无表达，Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织RECQ1表达率与Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织比较明显降低(P<0.05)；③Ki-67在正常脑组织组织中无表达，Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织RECQ1表达率为75%，与Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织比较明显降低(P<0.05)；④胶质瘤组织中RECQ1和Ki-67表达均为阳性的有57例(71.3%)，均为阴性的有14例(17.5%)。RECQ1阳性但Ki-67阴性的有4例(5%)，RECQ1阴性但Ki-67阳性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表达呈正相关(r= 0.768，P<0.01)。结论 RECQ1和Ki-67的表达随着脑胶质瘤组织恶性程度的增高而升高，且两者正相关。

脑胶质瘤；解旋酶RECQ1；Ki-67；相关性

脑胶质瘤多发于中青年人群，我国脑胶质瘤患者的发病率为每年3～6人/10万人，并且以每年1.2%的增长率逐年上升，死亡人数每年可达3万人〔1〕。现代医学多采取手术、放疗、化疗等疗法〔2〕，但由于本病生长部位特殊，很难根除，而且极易复发，预后并不理想。研究发现，解旋酶RECQ1存在于多种肿瘤中，而缺乏RECQ1基因的肿瘤细胞增殖、分化受到抑制〔3〕。有报道称，向小鼠肿瘤部位注射对RECQ1起沉默作用的RNA，可以明显抑制小鼠肿瘤的生长，RECQ1可以作为治疗脑胶质瘤的新靶点进行研究〔4〕。笔者通过观察脑胶质瘤和正常脑组织中RECQ1、Ki-67表达情况以及两者的相关性等指标，探索脑胶质瘤治疗的新靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2014年1月于我院以脑胶质瘤为诊断而收入院进行手术治疗的患者80例，男42例，女38例，平均年龄(45.3±5.3)岁，患者均未采用放疗、化疗等手段治疗，无其他恶性肿瘤性疾病。术中取得的胶质瘤组织，依照世界卫生组织2010年的神经系统肿瘤病理学分级标准分级〔5〕，其中Ⅰ～Ⅱ级44例，Ⅲ～Ⅳ级36例；正常脑组织20例，取自脑外伤进行减压术的患者，男13例，女7例，平均年龄(42.7±6.1)岁。两组患者的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。患者及家属自愿参与本实验，并签署知情同意书。方案获得我院伦理委员会批准并全过程跟踪。

1.2 主要试剂和仪器兔抗人RECQ1多克隆抗体(GeneTex)；兔抗人Ki-67单克隆抗体(上海领成)；二抗免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉)；PBS、多聚甲醛溶液(自配)；自动包埋机(湖北慧达)；切片机(无锡华宝)；细胞培养箱、恒温水浴箱(上海佳航)；光学显微镜(德国Leica)。

1.3 方法

1.3.1 标本制备每例分别取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的胶质瘤组织和正常脑组织，置于40 g/L多聚甲醛溶液中2 h进行固定，之后采用95%乙醇脱水，经2 h浸蜡，用自动包埋机制成蜡块，切片机制成厚度为4 μm的切片〔6〕。

1.3.2 免疫组化染色法按照抗体说明书进行操作，将制备好的切片置入恒温干燥箱中1 h，设置温度为60℃；分别利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡15 min；利用不同梯度乙醇(无水、95%、80%乙醇)逐级脱水：蒸馏水水化；利用3%过氧化氢液灭活内源性过氧化物酶，在室温下孵育30 min左右；用PBS液浸泡2次，5 min/次；切片浸入200 ml抗原修复液中修复，高压加热3 min，冷却至室温；擦净组织表面液体，加入血清工作液，置入温箱中1 h，温度为37°，中和非特异性反应；擦净玻片，分别加入兔抗人RECQ1抗体、ki-67抗体(RECQ1浓度稀释至1∶750，Ki-67浓度稀释至1∶100)，置于4℃过夜；复温后用PBS液浸泡2次，5 min/次；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育30 min；利用DAB染色；苏木轻度复染3 min；之后利用不同浓度酒精(80%、95%、无水乙醇)脱水；封片采用中性树胶。

1.3.3 镜下观察由两名病理医师分别在高倍镜(×400)下观察各标本，根据染色强度以及阳性细胞数评定RECQ1和 Ki-67的表达情况，两位医师的观察结果对比后作为最终结果。阳性细胞着色为淡黄色至棕褐色颗粒，颜色越深、范围越大，阳性率越强。根据染色程度评定标准〔7〕，1分：无染色或淡黄颗粒；2分：中等量棕黄颗粒；3分，棕色颗粒量大色深。根据阳性细胞计数，1分：阳性细胞少于5%；2分：存在5%～30%阳性细胞；3分：存在30%～65%阳性细胞；4分：存在65%以上的阳性细胞。染色程度得分×阳性细胞计数得分≤1分为阴性，2～6分属于低表达(+)，>7分者属高表达()。

1.4 统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验、χ2检验和秩和检验。

2 结果

2.1 免疫组化结果染色呈淡黄色至棕褐色颗粒，为阳性；RECQ1、Ki-67在正常脑组织中表达呈阴性，在胶质瘤组织表达呈阳性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织中多为低表达，在Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中多为高表达，见图1。

2.2 胶质瘤组织、正常脑组织中RECQ1、Ki-67的表达率比较 RECQ1、Ki-67在正常脑组织组织中无表达，Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织表达率与Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织比较明显降低(P<0.05)，见表1。

正常脑组织RECQ1

正常脑组织Ki-67

Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤RECQ1

Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤Ki-67

Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤RECQ1

Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤Ki-67

表1 胶质瘤组织、正常脑组织中RECQ1、Ki-67的表达比较〔n(%)〕

组别nRECQ1阴性低表达高表达表达率Ki⁃67阴性低表达高表达表达率Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤363(8 3)6(16 7)27(75 00)33(91 7)5(13 9)7(19 4)24(66 7)31(86 1)Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤4413(29 5)26(59 1)5(11 4)31(70 5)1)11(25 0)25(56 8)8(18 2)33(75 0)1)正常脑组织2020(100 0)0(0)0(0)020(100 0)0(0)0(0)0

与Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织比较：1)P<0.05

2.3 胶质瘤组织中RECQ1和Ki-67表达的相关性胶质瘤组织中RECQ1和Ki-67表达均为阳性的有57例(71.3%)，均为阴性的有14例(17.5%)。RECQ1阳性但Ki-67阴性的有4例(5%)，RECQ1阴性但Ki-67阳性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表达呈正相关(r=0.768，P<0.01)。

3 讨论

脑胶质瘤来源于神经上皮细胞，其发生可能与遗传因素、电离辐射、亚硝基化合物、病毒感染、空气污染等导致的基因突变有关〔8〕，随着社会的发展，环境污染的加重及人们生活方式的转变，脑胶质瘤发病率不断上升。脑胶质瘤多呈浸润性生长，手术难度大，且对放疗、化疗等治疗方式敏感性差，极易复发，这些特点使得其具有较高的死亡率，引起医学界的关注，近年来基因工程飞速发展，寻找新的治疗靶点成为目前常见的研究方向。解旋酶RECQ1属于解旋酶家族的一种，具有催化DNA、RNA链解旋的作用，能够促进DNA的复制、修复、转录，在多种肿瘤组织中为高表达，对肿瘤组织的增殖分化起到重要作用。资料显示，若RECQ1存在缺陷，肿瘤细胞的基因稳定性受到影响，增殖减慢〔9〕。Ki-67是一种核抗原，其在肿瘤细胞中等的作用已被证实，它与细胞周期有关，在肿瘤细胞中具有高表达率，是反映恶性细胞增殖活跃程度的指标〔10〕。

本研究结果提示RECQ1、Ki-67在胶质瘤组织表达率越高，肿瘤组织恶性程度越高，细胞增殖越快；相关性分析结果显示Ki-67的表达随RECQ1表达增高而升高，受其调控。

1 许志强，徐伦山，蒋晓江，等.脑胶质瘤的临床治疗进展〔J〕.中国临床神经科学，2010;8(4):431-5.

2 徐国政，袁先厚.脑胶质瘤靶向治疗新进展〔J〕.中国临床神经外科杂志，2011;16(9):568-72.

3 熊晓鹏，胡超苏.脑胶质瘤的放射治疗临床研究进展〔J〕.中国神经肿瘤杂志，2006;4(3):173-9.

4 吴小璐，杨初蔚，张建生，等.脑胶质瘤危险因素的病例-对照研究〔J〕.中国临床神经外科杂志，2008;13(7):400-1，405.

5 翟晓东.RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及意义〔D〕.石家庄：河北医科大学，2013.

6 苏钰清，李兰梅，高建洲，等.cyclinA和Ki-67在脑胶质瘤中的表达〔J〕.现代中西医结合杂志，2013;22(3):229-30，238.

7 苏钰清，李兰梅，王献明，等.cyclinA及相关因子p27～(kip1)、Ki-67在胶质瘤中的表达及相关分析〔J〕.现代中西医结合杂志，2013;24:2626-8.

8 朱航，雷迅，张帆，等.脑胶质瘤危险因素Meta分析及危险因素控制后发病率的变化趋势〔J〕.中国医科大学学报，2012;6:554-8.

9 任华.RecQ解旋酶分子特性的研究〔D〕.华东师范大学，2010.

10 王献明，苏钰清，李兰梅.p27～(kip1)和Ki-67在人脑胶质瘤中的表达及意义〔J〕.现代中西医结合杂志，2012；21(25):2739-40.

〔2014-11-16修回〕