我国部分省市牛副结核病的血清学调查与分析

孙 雨，马世春，董 浩，王晓英

（中国动物疫病预防控制中心，北京102600）

牛副结核病（Bovine paratuberculosis）是由副结核分支杆菌引起的以牛慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦为特征的人畜共患传染病［1］。牛副结核病的主要临床症状与病理变化是顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱褶、慢性肉芽肿性回肠炎。本病给养牛业造成很大的损失［2］。由于本病潜伏期长，传播快，加之人工培养副结核分支杆菌难度又高，因此加强对该病的流行病学调查与实验室诊断研究对其综合防控具有十分重要的意义［3］。除常规的临床诊断外，牛副结核病的确诊依赖于实验室诊断方法，主要是血清学诊断和病原学诊断方法［4］。由于我国大部分省市的牛均未进行副结核疫苗免疫，因此血清抗体阳性则表明其已经感染［5－8］。为了更全面、准确掌握我国部分省市牛副结核病的流行和分布情况，并进行相应风险分析和科学防控，本研究使用法国ID－VET 公司生产的牛副结核病抗体ELISA 试剂盒对我国河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重庆6个省市2014年－2015年收集的3 600头牛血清样品进行了牛副结核病感染调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 牛副结核病抗体ELISA 检测试剂盒，购自法国ID－VET 公司。

1.1.2 血清样品 2014年－2015年采自河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重庆6 个省市的规模化养殖场、种畜场、散养户牛血清样品共3 600份。按照样品来源省份分，其中河北800份、山西800份、青海200份、新疆1 000 份、西藏200 份、湖北200份、重庆400份。按照样品来源分，规模化养殖场牛血清1 000份，种畜场牛血清600份，集贸市场400份，散养户牛血清1 600份。按照动物品种分，奶牛血清2 400份，肉牛血清600份，牦牛血清400份。

1.2 方法

1.2.1 牛副结核病抗体检测 在ELISA 抗原包被反应孔中加入稀释好的血清样本110μL，振荡10s，充分混匀，置21℃温育45 min。弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3次后拍干，加入酶标记物100μL，置21℃温育30min后，弃去液体，洗涤3次后拍干，加入底物100μL，振荡混匀，21℃避光反应15min后，加入终止液100μL，振荡10s，5min～30min 内用酶标仪测定其光密度值，检测每批血样均设标准阴性、阳性和空白对照。具体操作见牛副结核病抗体（Ig G）检测试剂盒（ELISA 方法）。

1.2.2 结 果 判 定 阳 性 样 本OD 值（OD 阳 性）＞0.35；阳性样本OD 值（OD 阳性）与阴性样本OD值（OD 阴性）的比值＞3 的条件下检测的结果有效，否则试验不成立，需重新做。

按照以下S／P 百分值计算判定每个样品的结果：S／P＝（OD 样本－OD 阴性）／（OD 阳性－OD阴性）×100%；当S／P≤60%时结果判为阴性；S／P≥70%时结果判为阳性；60%＜S／P＜70%时结果判为可疑。

2 结果

2.1 2014－2015年我国部分省市牛副结核病抗体检测结果

本次共调查牛血清样品3 600份，检出牛副结核病抗体阳性样品共82份，平均阳性率为2.29%。各省市的牛血清均有阳性样品，阳性率从0.5%～3.75%不等。按照省份区分，重庆的阳性率最低为0.5%，山西的阳性率最高为3.75%，新疆阳性率为2.2%、河北阳性率为2%、青海阳性率为1.5%、重庆阳性率为0.75%、湖北阳性率为0.5%（图1）。

图1 2014－2015年我国部分省市牛副结核病抗体检测结果Fig.1 The test results of bovine paratuberculosis antibodies in some provinces of China from 2014to 2015

2.2 不同来源的牛血清中副结核病抗体检测结果

对2014－2015年不同来源的3600份牛血清通过ELISA 方法检测发现，采集于各省市散养户、种畜场、规模场和集贸市场的牛血清均能检测出副结核抗体阳性，阳性率从0.17%～3.06%不等。按照样品来源分，散养户的牛阳性率最高为3.06%，其次是集贸市场的牛阳性率为2.75%，规模化养殖场的牛阳性率为2.1%，最后是种牛场的牛阳性率为0.17%（图2）。

2.3 不同品种来源牛血清中副结核抗体检测结果

各省市的奶牛、牦牛和肉牛的血清中均能检测出副结核抗体，阳性率从0.83%～2.79%不等。按照动物品种来源分，牦牛血清的阳性率最高为2.79%，其次是奶牛血清的阳性率为2.5%，最后是肉牛血清的阳性率为0.83%（图3）。

图2 不同来源的牛血清中副结核抗体检测结果Fig.2 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different sources

图3 不同品种的牛血清中副结核抗体检测结果Fig.3 The detection results of paratuberculosis antibodies in bovine sera from different varieties

3 讨论

采用法国ID－VET 公司生产的牛副结核病抗体ELISA 检测试剂盒对我国河北、山西、青海、新疆、西藏、湖北、重庆6个省市采集的3 600份牛血清样品进行了牛副结核病抗体检测，从样品来源地、养殖方式与采样动物品种上进行了一次初步的调查，样品来源覆盖面较大，涉及到全国6个省市的规模化养殖场、种畜场、散养户的奶牛、肉牛和与牦牛。各省市 的牛血 清 均 有 阳 性，阳 性 率 从0.5%～3.75%不等，但是山西、河北、新疆等北方地区牛副结核病的阳性率一定程度上高于湖北与重庆等南方地区，说明牛副结核病在北方地区的流行情况要高于南方地区。按照样品来源分，散养户的牛阳性率最高为3.06%，其次是集贸市场为2.75%，规模化养殖场为2.1%，最后是种牛场为0.17%。说明养殖方式对该病的流行也有一定的影响。被副结核分支杆菌污染的周围环境、水源、粪便等是副结核病的主要传染来源。大型的规模化养殖场与管理严格的种牛场消毒卫生条件较好，人员、动物出入管理严格，饲养方式相对科学，感染率要小于养殖方式较为落后的农村散养户。按照动物品种来源分，奶牛血清的阳性率最高为2.79%，其次是牦牛血清的阳性率为2.5%，最后是肉牛血清的阳性率为0.83%。从结果上可以分析出奶牛对副结核分支杆菌最为易感，副结核病给奶牛业带来的经济损失也最大，其中牛奶是副结核病的主要感染源，被副结核分支杆菌污染的牛奶极易将病原传染给犊牛与人类造成公共卫生安全隐患。牦牛的血清阳性率明显高于肉牛，可能原因是大部分高原牦牛采取散养的饲养方式，卫生条件较差，管理较为混乱，被副结核分支杆菌污染的粪便随意排放到草原上严重污染了饲养环境。牦牛在放养食草过程中很容易采食到被病原菌污染的牧草，从而造成肠道感染，而肉牛养殖大多采取规范化的规模养殖场或养殖小区进行饲养，饲喂方式与卫生环境明显好于在高山草原放养的牦牛。牛副结核病对肉牛与牦牛的生产性能危害也较大，该病容易引起牛慢性增生性、顽固性肠炎和进行性消瘦，严重影响肉牛的产肉性能，所以牦牛与肉牛的副结核病同样需要引起兽医公共卫生方面的高度重视。

［1］ 田克恭.人与动物共患病［M］.北京：中国农业出版社，2013.

［2］ 杨 倩，王全凯，宋战昀，等.结核分支杆菌核酸适配体研究进展［J］.动物医学进展，2014，31（12）：122－126.

［3］ Tripathi B N，Stevenson K.Detection of Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis in formalin－fixed，paraffin embedded tissues of goats by IS900polymerase chain reaction［J］.Aust Vet J，2012，102（1）：84－88.

［4］ 付喜爱，张德显，周 维，等.细菌λRed重组技术的应用及其影响因素［J］.动物医学进展，2014，36（1）：91－95.

［5］ Lavers C J，Dohoo I R，McKenna S L，et al.Sensitivity and specificity of repeated test results from a commercial milk enzyme－linked immunosorbent assay for detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in dairy cattle［J］.J Am Vet Med Assoc，2015，246（2）：236－244.

［6］ Piras C，Soggiu A，Bonizzi L，et al.Identification of immunoreactive proteins of Mycobacterium aviumsubsp.paratuberculosis［J］.Proteomics，2015，15（4）：813－823.

［7］ Sztevn J，Wiszniewska A，Smolińska A.Evaluation of methods for Mycobacterium avium ssp.paratuberculosis detection in milk samples from the cattle herd showing low seroprevalence of Johne＇s disease［J］.Pol J Vet Sci，2014，17（3）：459－463.

［8］ 张源淑，摘译.琼脂凝胶免疫扩散试验盒检测绵羊副结核分支杆菌抗体效果的评价［J］.动物医学进展，1999，29（1）：60－61.