银翘蓝芩口服液薄层色谱鉴别方法研究

2015-06-11许春燕刘希望杨亚军郭沂涛李剑勇

动物医学进展 2015年11期

许春燕，刘希望，杨亚军，郭沂涛，李剑勇

（农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州730050）

中兽药具有多靶点及病原微生物对其不易产生耐药性的优点，在抗菌抗病毒的同时，还能促进动物生长、提高机体抗病力，其在兽医临床上的应用广泛，取得了良好效果［1］。研究表明，中药复方在防控禽类传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）方面有显著的临床效果［2］。口服液是在汤剂、散剂基础上发展起来的新剂型，具有剂量小、吸收较快、质量稳定、携带和服用方便、易于保存等优点，在制剂中占有比例逐年上升［3］。

银翘蓝芩口服液由金银花、连翘、板蓝根、黄芩等中药组成，是从中兽医整体观出发，辨证加减并通过临床疗效试验筛选后研制成的新型中兽药产品。该口服液以传统中医学理论为基础，运用现代药物制剂技术，经过将金银花、连翘、板蓝根、黄芩等中药材与水共煎煮醇沉等工艺，富集其有效成分制备而成。药效学表明，银翘蓝芩口服液清热解毒、解表平喘，具有抑菌、免疫促进等药学作用［4－5］。金银花具有清热解毒、抗病原微生物、抗炎、免疫调节、清除自由基等作用，且对常见的呼吸道病毒有较强的抑制作用［6］，绿原酸是其主要有效成分，药理活性显著，常作为金银花薄层色谱鉴别指标［7］。连翘有辛凉清热、芳香辟邪的功效，被认为是中药中的抗生素，其主要生物活性成分连翘苷具有较强抗菌作用，常作为连翘薄层鉴别指标［8－9］。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎之效，其有效成分黄芩苷对多种病毒有抑制作用，常选取黄芩苷作为黄芩薄层鉴别指标［10－13］。苦参味苦，性寒，具有清热燥湿，杀虫利尿的功效，苦参碱及氧化苦参碱是其主要药理活性成分，也是其薄层鉴别的常用指标［14］。

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）具有操作方便、设备简单、分离效率高、专属性好、分析快、色谱参数易调整等特点，在药物分析中，特别是复方制剂中应用广泛［15－16］。为了更好的控制该复方口服液的产品质量，本研究采用TLC法对该复方口服液中的金银花、连翘、黄芩及苦参进行了定性鉴别，为口服液质量控制提供理论依据［17］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品供试品银翘蓝芩口服液，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兽药研究室自制；金银花对照药材（批号121060－201107）、绿原酸对照品（批号110753－200413）、连翘对照药材（批号120908－201216）、连翘苷对照品（批号110821－201112）、黄芩对照药材（批号120955－201008）、黄芩苷对照品（批号110715－201117）、苦参对照药材（批号121019－200106）、苦参碱（批号110805－200508）、氧化苦参碱对照品（批号110780－200506），购自中国食品药品检定研究院；硅胶G 板（10cm×10cm），青岛海洋化工有限公司产品；聚酰胺薄膜（10cm×10cm），国药集团化学试剂有限公司产品；其余试剂均为分析纯；水为去离子水。

1.1.2 仪器设备 ME235S赛多利斯微量天平，北京赛多利斯天平有限公司产品；DRT－SX 电子调温电热套，郑州长城科工贸有限公司；R－215旋转蒸发仪，BUCHI SWITZERLAND。

1.2 方法

1.2.1 金银花薄层鉴别取供试品银翘蓝芩口服液1mL，加甲醇1mL，制成供试品溶液。取金银花粉末0.2g，加甲醇5mL，超声30min，滤过，滤液作为对照药材溶液。取绿原酸对照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取金银花外的其他中药材，制得缺金银花阴性口服液，按照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。吸取上述4 种溶液各2μL，分别点于同一以0.04 g／mL醋酸钠水溶液浸泡过的硅胶G 薄层板上，以乙酸丁酯－甲酸－水（7∶2.5∶2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.01g／mL 亚硝酸钠甲醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

1.2.2 连翘薄层鉴别取供试品银翘蓝芩口服液20mL，通过D101型大孔吸附树脂（内径为2cm，柱高为10cm），用100mL 超纯水洗脱，弃去洗液，再用乙醇－水（30∶70）溶液120mL洗脱，弃去洗液，最后用乙醇－水（50∶50）溶液120mL 洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取连翘对照药材0.5g，加甲醇10mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL使溶解。取连翘苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取连翘外的其他中药材，制得缺连翘阴性口服液，按照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。吸取对照品溶液2μL，其余3种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇（5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.1mL／mL硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品和对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。

1.2.3 黄芩薄层鉴别取供试品银翘蓝芩口服液5mL，加水15mL，用稀盐酸调节pH 至1，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并两次乙酸乙酯提取液，蒸干，残渣加甲醇2 mL 使溶解，作为供试品溶液。取黄芩对照药材0.5g，加乙酸乙酯－甲醇（3∶1）的混合溶液30mL，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5mL 使溶解，作为对照药材溶液。取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含1mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取黄芩外的其他中药材，制得缺黄芩阴性口服液，按照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。吸取上述4种溶液各4μL，分别点于同一聚酰胺薄薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶6∶3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.02g／mL 三氯化铁水溶液。供试品色谱中，应在与对照品及对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。

1.2.4 苦参薄层鉴别取供试品银翘蓝芩口服液5mL，加水5mL，加浓氨试液1mL，混匀，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取苦参对照药材粗粉0.5g，加三氯甲烷10 mL，浓氨试液0.2mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷0.5mL 使溶解，作为对照药材溶液。取苦参碱对照品和氧化苦参碱对照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取苦参外的其他中药材，制得缺苦参阴性口服液，照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。吸取上述4种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－浓氨试液（8∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品和对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2 结果

2.1 金银花薄层鉴别

3批供试品银翘蓝芩口服液的薄层色谱中，在与绿原酸对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的土褐色斑点；在与金银花对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色3个斑点；阴性对照品在相同位置无相应斑点，即该方法阴性对照无干扰，方法具有专一性（图1）。

图1 银翘蓝芩口服液中金银花TLC图Fig.1 TLC of Lonicera japonicain Yinqiao lanqin oral liquid

2.2 连翘薄层鉴别

3批供试品银翘蓝芩口服液的薄层色谱中，在与连翘苷对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的红褐色斑点；在与连翘对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；连翘阴性对照在相同位置无相应斑点，即阴性对照无干扰，方法具有专一性（图2）。

图2 银翘蓝芩口服液中连翘TLC图Fig.2 TLC of Forsythia suspensain Yinqiao lanqin oral liquid

2.3 黄芩薄层鉴别

3批供试品银翘蓝芩口服液的薄层色谱中，与黄芩苷对照品色谱相应的位置上，显示相同颜色的墨绿色斑点；与黄芩对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的斑点；阴性对照在相同位置无相应斑点，即阴性对照无干扰，方法具有专一性（图3）。

图3 银翘蓝芩口服液中黄芩TLC图Fig.3 TLC of Scutellaria baicalensis in Yinqiao lanqin oral liquid

2.4 苦参薄层鉴别

3批供试品银翘蓝芩口服液的薄层色谱中，在与苦参碱和氧化苦参碱对照品色谱相应的位置上，显示相同橘红色斑点；在与苦参对照药材色谱相应的位置上，显示相同橘红色斑点；苦参阴性对照在相同位置无相应斑点，即阴性对照无干扰，方法具有专一性（图4）。

3 讨论

图4 银翘蓝芩口服液中苦参TLC图Fig.4 TLC of Sophora flavescens in Yinqiao lanqin oral liquid

根据《中国兽药典》中各味药材及其他复方制剂中相应中药材的薄层色谱鉴别方法，通过试验，确定了金银花、连翘、黄芩及苦参的定性鉴别方法。在金银花的鉴别中，起初参照《中国兽药典》2010年版二部金银花药材薄层鉴别方法试验，结果发现该方法分离度较差，且斑点不清晰。后参照《中国药典》2010年版一部小儿感冒宁糖浆质量控制研究中金银花的鉴别方法，展开剂合适，结果斑点清晰，方法专一。在连翘的鉴别中，起初参照《中国兽药典》2010年版二部中连翘药材薄层鉴别方法试验，结果发现连翘苷由于含量较低，薄层鉴别的斑点不明显。因此，尝试了用乙酸乙酯提取、浓缩，提高连翘苷含量的方法，效果仍不明显。原因可能是连翘苷属于大极性化合物，在水中溶解度较高，乙酸乙酯萃取并不能有效富集连翘苷。最终参考《中国药典》2010年版一部清热解毒口服液中连翘的鉴别定方法，采用大孔吸附树脂富集连翘苷并除去其他杂质，结果显示斑点清晰，方法专一。在黄芩的鉴别中，起初参照《中国兽药典》2010 年版二部黄芩药材的薄层鉴别方法试验，结果发现分离度较差，且其他成分干扰较严重。最后参照《中国药典》2010 年版一部小儿感冒颗粒质量控制研究中黄芩的鉴别方法，结果斑点清晰，方法专一。在苦参的鉴别中，参照《中国兽药典》2010 年版二部药材苦参的薄层鉴别方法试验，对口服液样品及阴性对照品采用加适量氨水游离出苦参碱和氧化苦参碱，再用三氯甲烷提取浓缩的办法进行富集、除杂。结果发现该方法分离度好，斑点清晰，方法专一。

本中兽药复方口服液为清热解毒、解表平喘的新兽药产品，为了该复方口服液的推广使用，需建立质量标准以保证复方口服液的质量。本研究采用的TLC法可以对该复方口服液的主要药材进行薄层色谱鉴别，且方法简便、专属性强，因此可以达到控制银翘蓝芩口服液质量的目的。

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