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活血化痰方干预糖尿病大鼠的尿液代谢组学分析*

2015-06-11赵慧辉陈建新

中国中医基础医学杂志 2015年11期
关键词:离子流代谢物组学

潘 秋,赵慧辉,陈建新,董 芳,王 伟△

(1.北京市门头沟区中医院内分泌科,北京 102300;2.北京中医药大学研究生院,北京 100029;3.首都师范大学分析测试中心,北京 100037)

采用高脂饲料叠加腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)制备的糖尿病大鼠模型在糖尿病研究中应用广泛。笔者在前期研究中发现,该模型具备中医证候属性,属于“脾气亏虚、痰瘀互阻”证范畴[1-2]。文献研究结果亦证实,此证候在临床实际中出现频率较高[3],因此此种造模方法复制的糖尿病模型符合中医药研究需求。笔者以导师临床经验为指导思想,以具有活血化痰功效的复方(苍术、白术、黄芩、丹参)反证糖尿病大鼠模型的证候属性,并借助高通量组学技术,旨在阐释中医证候的生物学特点和复杂中医药干预手段的多靶点效应。代谢组学是目前新兴的系统生物学技术之一,其与中医学有着异曲同工之妙,因此笔者拟采用代谢组学技术,从微观角度动态揭示中药复方疗效的生物学特征,通过气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)等技术建立动态的大鼠尿液“代谢指纹图谱”,通过数据分析最终找出特征性的代谢产物群,确定“中医证候疗效相关代谢谱”。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性8周龄SD大鼠80只,体质量(220±10)g,由北京维通利华实验动物中心提供(许可证号SCXK(京)2002-0003)。饲养于北京中医药大学清洁级动物室,室温18~25℃,相对湿度50% ~60%,大鼠适应性饲养1周。

1.2 饲料

普通饲料及高脂饲料购于中国科学院动物所。高脂饲料配方(按质量比):20%猪油,10%蔗糖,23%酪蛋白,0.3%蛋氨酸,28%淀粉,10%糊精,7.5%纤维素,0.3%胆碱,0.1%多维预混料,0.8%多矿预混料[4]。

1.3 药物

活血化痰方由苍术、白术、黄芩、丹参等按比例组成,由北京中医药大学中药学院提供,采用水提法制成1 g/ml水溶液,中药组大鼠每日8时灌胃,药液于4℃冰箱保存;西药组大鼠给予马来酸罗格列酮片,购自葛兰素史克公司,制成0.2 mg/ml水溶液,每日同时间灌胃。

1.4 试剂

STZ(批号S0130),购自北京邦定泰克生物技术有限公司;乙腈(A996-4),Fisher Scientific;吡啶(110-86-1),MREDA TECHNOLOGY INC;三氯甲烷(67-66-3),MREDA TECHNOLOGY INC;17碳脂肪酸(H3500-5G)、TMCS(386529-100 ml)、N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺(394866 10×1 ml),均为美国Sigma试剂公司提供。

1.5 仪器

美国Finnigan Trace 2000/Trace DSQ气相色谱-质谱联用仪,配有RTx-5毛细管柱、Xcalibur工作站、NIST谱库;氮气吹干机。

1.6 方法

1.6.1 造模方法 模型组高脂饮食喂养6周后,腹腔注射STZ 35 mg/kg,对照组普通饮食喂养6周后,腹腔注射同等剂量0.1 M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,注射STZ 4周后2组大鼠尾静脉采血检测血糖,凡血糖值符合空腹血糖≥11.1 mmol/l者纳入实验[5]。

1.6.2 分组 按血糖水平将大鼠从轻到重依次编号,按随机数字表选择一行数字,每3只大鼠同时分组,规定根据随机数字由小到大分别进入中药组、西药组、模型组。中药组每只大鼠分别灌胃4 ml,西药组每只大鼠灌胃马来酸罗格列酮1 ml,模型组和对照组均灌服制水,每日8∶00给予灌胃,连续灌胃6周。

1.6.3 血糖、血脂测定 实验6周过程中每周测定OGTT30 min血糖,出现血糖恢复的大鼠则给予剔除;血脂检测交由东直门医院检验科。

1.6.4 尿样留取 药物干预第3周末及第6周末分别利用代谢笼留取中药组、模型组、对照组大鼠24 h尿液,每组随机选取8只,每只大鼠留取尿液1ml,分别保存于不同的试管中,检测前保存于-80℃冰箱。

1.6.5 GC-MS样本预处理 600 μL尿液,加入10 μL内标(17碳脂肪酸6 mg/ml),加入400 μL乙腈,涡旋混合1 min,冰浴超声10 min,18000 r/min,4℃离心5 min,取上清干净试管中,氮气吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(15 mg/ml)混匀,30℃肟化2 h。加衍生化试剂(MST-FA:TMCS=100∶1,v/v)50 μL,混匀静置。1 h后移取上清液到微量进样管,供 GC-MS 分析[6]。

1.6.6 GC-MS分析条件 气相条件:分流比,1∶1.进样量 0.5 μL。进样口温度 280℃,接口温度250℃;升温程序80℃;保持2 min,以每分钟10℃升至140℃,以每分钟 4℃升至240℃,再以每分钟10℃升至280℃,保持3 min。离子源温度200℃,载气高纯度氦气。质谱条件:载气流速,1.0 ml/min;电离方式EI;电子能量70 eV,扫描范围50~800 m/z[7]。

1.6.7 总离子流图分析 物质鉴定采用质谱自带软件;GC-MS总离子流图中各峰的保留时间挑选共有峰,获取各峰与内标峰的峰面积数据,用相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量。

1.6.8 统计学方法 根据GC-MS总离子流图中各峰的保留时间挑选共有峰,获取各峰与内标峰的峰面积数据,用相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量[8]。各组模式识别采用主成分分析(PCA),应 用 SIMCA-P+软 件 (V12.0.1,Umetrics,Sweden)。

2 结果

2.1 血糖水平

表1显示,39只大鼠造模成功,18只大鼠血糖恢复给予剔除,3只大鼠死亡。西药组灌胃4周后血糖水平出现下降(P<0.05)。同样在随后第5~6周血糖水平持续处于低位水平;模型组大鼠灌服制水,血糖水平前后6周始终保持稳定(P>0.05)。

表1 葡萄糖耐量实验30 min血糖(mmol/L)

2.2 血脂水平

表2显示,与模型组比较,中药组灌胃6周后大鼠的胆固醇、甘油三酯及低密度脂蛋白水平明显低于模型组(P<0.05);西药组灌服6周后大鼠的胆固醇水平低于模型组(P<0.05);与西药组比较,中药组低密度脂蛋白水平优于西药组(P<0.05),其余指标水平相当(P>0.05)。

2.3 总离子流图

图1~8显示,第3周和第6周中药组、西药组、模型组和对照组总离子流图。

2.3.1 第3周总离子流图

2.3.2 第6周总离子流图

表2 4组大鼠CHO TG HDL LDL水平比较

图1 中药组总离子流图

图2 西药组总离子流图

图3 模型组总离子流图

图4 对照组总离子流图

图5 中药组总离子流图

图6 西药组总离子流图

图7 模型组总离子流图

图8 对照组总离子流图

图9 模型组前后比较尿液TIC谱图数据PCA得分图

2.4 代谢物鉴定

表3显示,共有峰挑选后发现尿液中共有内源性代谢物9种。利用NIST质谱数据库对共有的内源性代谢物作鉴定,按通常匹配度大于80%的鉴定结果作为可信度较大的物质。按保留时间分别为丙氨酸、戊二酸、L-抗坏血酸、D-葡萄糖酸、棕榈酸、十八烷酸、单甘油。

表3 GC-MS尿液代谢物鉴定

2.5 GC-MS图谱模式识别分析

2.5.1 模型组前后比较 模型组前后2个时间点PCA得分图和载荷图结果表明,2组基本可以沿t1轴分开,PCA前2个主成分累积得分为67.2%,叠加后续2个主成分,共计4个主成分累积得分85.7%,可覆盖大部分代谢物信息。在前2个主成分得分图中可见各样品分布于得分图的2个区域,第6周样本分布于右方,第3周样本分布于左方(结果见图 9、10)。

2.5.2 同一时间点模型组、对照组比较 ①第3周模型组、对照组互相比较:模型组、对照组PCA得分图和载荷图结果表明,2组基本可以沿t2轴分开,PCA前2个主成分累积得分为67.4%,叠加第3个主成分,共计3个主成分累积得分84.2%,可覆盖大部分代谢物信息。在前2个主成分得分图中可见各样品分布于得分图的2个区域,对照组样本分布于上方,模型组样本分布于下方(结果见图11、12)。②第6周模型组、对照组互相比较:模型组、对照组PCA得分图和载荷图结果表明,2组基本可以沿t1轴分开,PCA前2个主成分累积得分为53.3%,叠加后续3个主成分,共计5个主成分累积得分85.8%,可覆盖大部分代谢物信息。在前2个主成分得分图中可见,各样品分布于得分图的2个区域,对照组样本分布于左方,模型组样本分布于右方(结果见图13、14)。

图10 模型组前后比较尿液TIC谱图数据PCA载荷图

图11 第3周模型组、对照组尿液TIC谱图数据PCA得分图

图12 第3周模型组、对照组尿液TIC谱图数据PCA载荷图

图13 第6周模型组、对照组尿液TIC谱图数据PCA得分图

图14 第6周模型组、对照组尿液TIC谱图数据PCA载荷图

图15 中药组前后比较尿液TIC谱图数据PCA得分图

图16 中药组前后比较尿液TIC谱图数据PCA载荷图

图17 西药组前后比较尿液TIC谱图数据PCA得分图

图18 西药组前后比较尿液TIC谱图数据PCA载荷图

2.5.3 中药组前后比较 中药组前后2个时间点PCA得分图和载荷图结果表明,2组基本可以沿t2轴分开,PCA前2个主成分累积得分49.0%,叠加后续3个主成分,共计5个主成分累积得分86.9%,可覆盖大部分代谢物信息。在前2个主成分得分图中可见各样品分布于得分图的2个区域,第6周样本分布于下方,第3周分布于上方(结果见图15、16)。

2.5.4 西药组前后比较 西药组前后2个时间点PCA得分图和载荷图结果表明,2组基本可以沿t1轴分开,PCA前2个主成分累积得分72.5%,叠加第3个主成分,共计3个主成分累积得分87.2%,可覆盖大部分代谢物信息。在前2个主成分得分图中可见各样品分布于得分图的2个区域,第6周本分布于右方,第3周布于左方(结果见图17、图18)。

2.6 代谢物组内及组间比较结果

2.6.1 组间比较 第3周根据主成分分析结果,各组比较未见统计学差异;第6周与对照组比较,模型组L-抗坏血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、丙氨酸、戊二酸、十八烷酸含量增加(P<0.05或P<0.01)(结果见表3)。

2.6.2 组内比较 第6周中药组L-抗坏血酸(29 min)含量减少(P<0.05);第6周模型组L-抗坏血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量增加(P<0.05或P<0.01)(结果见表4)。

3 讨论

3.1 尿液代谢物浓度的变化

笔者以往实验研究表明,糖尿病大鼠前3周证候属性以脾气亏虚证为主,后3周证候属性以痰瘀互阻证为主。尿液代谢物鉴定结果显示,与第3周比较,第6周模型组大鼠尿液中L-抗坏血酸(29 min)、D-葡萄糖酸、十八烷酸和戊二酸含量均明显增加。L-抗坏血酸含量增高可能是大鼠发生糖尿病后体内氧化水平激增,机体通过自身调节而出现的抗氧化反应;十八烷酸是硬脂酸,属于高级饱和脂肪酸,存在于部分植物性油脂和动物性油脂中,饱和脂肪酸的增加可能会引起血液中胆固醇含量上升,并促使机体对胰岛素等激素产生抵抗,导致血糖升高等代谢紊乱情况出现。查阅KEGG检索丙氨酸与相关疾病的关系发现,丙氨酸异常多见于代谢异常性疾病,这可为今后实验提供继续研究的靶点。综上所述,几种代谢物的组合规律及其含量的变化基本可以阐释大鼠中医证候的相关代谢物特征。

表4 GC-MS大鼠尿液代谢物组内及组间比较(例)

3.2 活血化痰方的药效机制

尿液代谢物鉴定结果显示,与第3周比较,第6周中药组大鼠尿液中L-抗坏血酸含量减少,可能是中药复方减轻糖尿病大鼠体内的氧化应激作用,因而L-抗坏血酸含量反应性下降。同时,第6周中药组大鼠尿液出现部分代谢物消失,包括丙氨酸、棕榈酸、十八烷酸和单甘油,并出现了新的代谢物如L-抗坏血酸等物质,可能是中药复方增强了抗氧化作用;此外,硬脂酸和软脂酸含量减少,提示中药具有改善血脂代谢的作用,可能是通过改善血脂代谢进而影响了血糖水平,或者是通过减轻胰岛素抵抗的间接作用而改善高血糖状态;丙氨酸水平的下降,从一定程度上说明中药影响了部分氨基酸代谢通路,改善了代谢紊乱状态。

3.3 气质联用技术

气质联用技术主要应用在植物代谢组学研究中,分析时需对样品进行衍生化处理以增加样品的稳定性和挥发性,利于用GC-MS中的气相色谱仪进行分离。因此,GC-MS限于分析挥发性物质,无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。笔者以糖尿病病证结合大鼠的尿液为样本,根据不同组别、不同代谢产物含量变化对大鼠的证候和证候疗效做出初步阐释。如果结合其他代谢组学技术,可能会发现更多有意义的代谢物,以便更深入地阐释糖尿病病证结合大鼠的证候特征以及证候疗效的科学内涵。由于国内关于代谢组学的研究起步较晚,而涉及糖尿病中医学范畴的文献研究也比较少,因此可借鉴的研究结果为数不多。对于实验结果在2型糖尿病病证结合动物模型的其他证型中是否有相同实验结果或者出现新的标志性代谢物,这将是课题组今后实验研究的重点所在。

受到大鼠样本量的限制和大鼠模型的个体差异,各组大鼠尿液代谢物在种类和含量上出现一定程度的偏差,笔者建议在今后的实验中可以从两方面进行改进。首先可以增加实验动物的样本量,二是可以提高实验动物的造模严重程度,有利于发现差异明显的代谢物群。此外,作为最终代谢物,大鼠的尿液可能在疾病程度较轻的阶段不出现明显的变化,笔者认为可以结合血液检测方法开展血液代谢组学研究,可能会发现与糖、脂、蛋白代谢紊乱明显相关的生物标志物。同时,今后的研究也可以借助系统生物学的其他技术方法如蛋白组学和基因组学,深入开展2型糖尿病大鼠病证结合研究,期望通过不同组学技术交叉印证证候的相关生物学机制,并借助复杂统计学方法,将系统生物学结果与一般实验指标、宏观表征融合成有机的整体,探索出一条由宏观延伸到微观、由微观反证宏观的有效实验方法,探寻宏观指标和微观指标之间的关联性,努力找到可以代替微观指标的宏观指标,以此加快证候研究的步伐。

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