应用代谢组学探讨脾气虚大鼠血清小分子代谢谱群特征变化❋

徐 荧，贾连群，杜 莹，甄毕贤，杨关林

(辽宁中医药大学省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110847)

应用代谢组学探讨脾气虚大鼠血清小分子代谢谱群特征变化❋

徐 荧，贾连群，杜 莹，甄毕贤，杨关林△

(辽宁中医药大学省部共建中医脏象理论及应用教育部重点实验室，沈阳 110847)

目的:运用代谢组学技术探究脾气虚模型大鼠血清小分子代谢谱群特征变化，从而探索脾气虚证的生物学本质。方法:14只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组和脾气虚证模型组各7只，模拟中医病因建立脾气虚大鼠模型。运用LC-Q/TOF-MS质谱技术对2组大鼠血清样本进行检测，通过主成分分析(PCA)、最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)比较2组大鼠血清代谢图谱，寻找差异性表达代谢物。结果:脾气虚大鼠与正常大鼠的血清代谢图谱间存在显著差异。与正常大鼠比较，脾气虚大鼠血清中葡萄糖、琥珀酸等小分子代谢物含量显著上升，雄酮、亚油酸等含量显著下降，通过OPLS-DA分析得到一些脾气虚证的潜在生物标志物。结论:脾气虚大鼠呈现出不同于健康大鼠的血清代谢谱群特征，该证型存在多种代谢通路异常，可能伴随机体能量供应障碍，也可能诱发糖尿病及心血管疾病。

脾气虚证;代谢组学;大鼠;血清

脾气虚是中医临床的一种常见证型，与消化系统、能量代谢、心血管功能等多种系统功能的紊乱失常有关［1］。目前已确认的脾气虚特异性指标中较为公认的只有唾液淀粉酶和D-木糖排泄率，且这2项指标只能反映脾气虚证的局部［1］，因此对于脾气虚证实质的研究仍有待深入。代谢组学是通过定量检测生物体受到外界刺激和遗传修饰后生物基质中各种代谢产物的变化来研究生物体系代谢网络的一种技术方法［2］，其研究对象是生物体整体代谢物，与中医理论的“整体观念”相一致，因此适用于中医证候的研究。本实验通过建立脾气虚证动物模型，运用代谢组学技术，分析脾气虚大鼠与健康大鼠的血清差异性小分子代谢物及其相关代谢通路，从而探索脾气虚证的生物学本质。

1 材料与方法

1.1 动物分组与建模

14只健康雄性SPF级SD大鼠，体质量(200± 10)g，购于本溪实验动物中心(许可证号 SCXK (辽)-2010-0001)。按随机数字表法分为正常对照组(正常组)和脾气虚证模型组(脾气虚组)每组7只。于辽宁中医药大学实验动物中心(许可证号SYXK(辽)-2013-000-9)适应性饲养1周，室温18～23℃，相对湿度45% ～55%，自由饮水进食。1周后，正常组维持适应性饲养条件继续饲养15 d。脾气虚组使用饮食不节加力竭游泳方法建立脾气虚证模型，3 d为1个循环，先饱食1 d再禁食2 d，自由饮水，每日35～37℃水温游泳至力竭，连续15 d共5个循环。脾气虚证评定标准为食少、神疲乏力、消瘦、毛色枯槁无光泽，造模成功率约为80%。

1.2 血清采集与样品制备

腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用大鼠腹主动脉取血，静置2 h后4℃离心(2500 rpm)20 min并收集血清分装，-80℃保存。取冷冻储存的样本，室温下解冻15 min，涡漩震荡5 s。取100 μL样本加入300 μL HPLC级甲醇，涡漩震荡30 s，4℃静置20 min。4℃冷冻离心(12000 rpm)15 min，取200 μL上清液转入进样小瓶，进行LC/MS检测分析。实验试剂为甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵(美国默克公司色谱级试剂)，实验用水为蒸馏水。

1.3 LC/MS质谱检测

实验仪器分析平台为LC-Q/TOF-MS(Agilent，1290 Infinity LC，6530 UHD and Accurate-Mass QTOF/MS)，分离色谱柱为C18色谱柱(Agilent，100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。色谱分离条件:柱温40℃，流速0.4 ml/min，流动相组成A:水+0.1%甲酸，B:乙腈+0.1%甲酸。自动进样器温度4℃，进样量5 μL。

表1 质谱梯度洗脱程序

质谱条件:以氮气作为雾化、锥孔气;飞行管检测模式V型。毛细管电压(capillary voltage)4 kV，锥孔电压(Sampling cone)35 kV，离子源温度(Sourcetemperature)100 ℃;脱溶剂气 温 度 (Desolvation temperature)350℃，反向锥孔气流(Cone gas flow)50 L/h，脱溶剂气(Desolvation gas flow)600 L/h，萃取锥孔(Extraction cone)4 V。离子扫描时间(Scan time)0.03 s，扫描时间间隔(Inter scan time)0.02 s，数据采集范围100～1000 m/z。为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽作为锁定质量(Lock mass)，正离子模式下产生［M +H］+离子556.2771 Da，负离子模式下产生［MH］-离子554.2615 Da。

1.4 数据分析

使用的载玻片和盖玻片必须无划痕且无灰尘，物镜前透镜也须清洁无尘。载玻片与盖玻片的厚度应符合标准。载玻片太厚，聚光器的焦点将落在载玻片内，达不到被检物体的平面上；使用油镜头时，由于物镜的工作距离很短，甚至无法调焦，从而看不到或看不清被检物体。

通过安捷伦工作站MassHunter对所有原始质谱数据进行预处理并导出mz格式数据。在R软件平台下采用xcms程序代码进行数据预处理，包括基线过滤、峰识别，进行保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属等分析。最后在EXCEL2007软件中进行后期编辑，包括来自于柱流失和样本制备造成的杂质峰剔除和定量离子选择等。将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量(rt_mz，即保留时间-质荷比)、观察量(样本)和峰强度。将所有数据归一化到总信号积分，将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件(版本11.0)，进行主成分分析(PCA)、最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)。采用 OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection)(阈值＞1)，并结合学生氏 t检验(t-test)的 P值(阈值0.05)来寻找差异性表达代谢物。定性方法为搜索公共网络数据库(Metlin以及HMDB)。

图1 正常组与脾气虚组TIC色谱图

2 结果

2.1 血清代谢TIC色谱图分析

图1显示，采用LC/MS质谱ESI正离子和负离子模式，对正常对照组(正常组)和脾气虚证模型组(脾气虚组)的动物血清进行代谢组学分析。2组动物血清的总离子流(TIC)色谱图显示，各组分的分离效果较好，且在正离子和负离子模式下2组的TIC图谱均存在明显差异。

2.2 血清代谢多元统计分析

图2显示，ESI正离子模式和负离子模式下样本均处于椭圆形区域内(95%置信区间)，且分析参数R2X［R2X(+)=0.576;R2X(-)=0.507］均大于0.4，因此该组PCA模型能可靠解释样本间的代谢差异。PCA得分图(见图2)显示，脾气虚组与正常组在正离子和负离子模式下均沿t［1］轴方向基本分开，2组间无明显交叉重叠，说明2组样本间血清代谢图谱存在显著差异。

图2 正常组与脾气虚组PCA得分散点分布图

通过主成分分析未发现异常需要剔除的样本，所以进一步采用最小二乘判别分析(PLS-DA)进行建模分析。图3显示，ESI正离子和负离子模式下样本均处于椭圆形区域内(95%置信区间)，且模型的解释率 R2Y［R2Y(+)=0.997;R2Y(-)= 0.989］与预测率Q2［Q2(+)=0.897;Q2(-)= 0.857］均大于0.4，因此该组PLS-DA模型也能可靠地解释样本间的代谢差异。PLS-DA得分图(图3)显示，脾气虚组与正常组在正离子模式下被图中所示虚线基本分开，在负离子模式下沿t［1］轴方向基本分开，2组间无明显交叉重叠，进一步说明2组样本间血清代谢图谱存在显著差异。

图3 正常组与脾气虚组PLS-DA得分散点分布图

2.3 血清差异性代谢物分析

表2、3显示，通过正交偏最小二乘(OPLS-DA)分析，ESI正离子模式下正常组与脾气虚组间确认了49个差异性代谢物，负离子模式下2组间确认了28个(4个与正模式下重复)差异性代谢物。与正常组比较，脾气虚组中葡萄糖、琥珀酸、胸苷等44个小分子代谢物在血清中浓度显著上升(P＜0.05)，雄酮、亚油酸、苯丙氨酸等29个小分子代谢物浓度显著下降(P＜0.05)。

3 讨论

代谢组学是一门新兴的现代生物学技术，与基因组学和蛋白质组学比较具有显著优势［2］。其研究对象是生物体整体代谢物，与中医整体观相吻合，近年来开始应用于中医药领域的研究中。本实验运用代谢组学技术，清晰直观地反映正常对照组(正常组)和脾气虚证模型组(脾气虚组)间存在代谢图谱的显著差异，并确认了2组间的差异性代谢物，说明血清代谢组学分析能够较好地反映中医模型的组间差异，是展开中医证候研究的有效方法。

3.2 脾气虚证的潜在生物标志物

差异性代谢物分析结果显示，与健康大鼠比较，脾气虚大鼠血清中磷脂酸(18∶3)、马尿酸、吲哚乙酸、胸苷、三烯生育酚、3-Oxocholic acid、胆酸、L-(-)-3-苯基乳酸、D(-)-β-羟基丁酸、2-oxo羊蜡酸等小分子代谢物浓度改变较为明显，这些小分子代谢物可作为脾气虚证潜在生物标志物做进一步研究。

表2 ESI正离子模式下正常组与脾气虚组血清差异性代谢物

3.3 脾气虚证是机体多种代谢通路异常的共同结果

中医认为，脾为“后天之本，气血生化之源”。脾气虚是中医临床常见的一种证型，涉及消化、免疫、内分泌等系统功能紊乱。本实验运用代谢组学技术分析比较了脾气虚大鼠与健康大鼠的血清代谢图谱。LC/MS质谱分析和多元统计分析结果显示，脾气虚大鼠与健康大鼠的血清代谢图谱间存在显著差异。差异性代谢物分析结果进一步显示，2组动物血清中许多小分子代谢物含量存在显著差异，说明比较健康大鼠脾气虚大鼠的相关代谢通路发生了改变。

表3 ESI负离子模式下正常组与脾气虚组血清差异性代谢物

3.3.1 能量代谢方面 与健康大鼠比较，脾气虚大鼠血清中琥珀酸、延胡索酸、苹果酸的含量水平显著升高。琥珀酸、延胡索酸、苹果酸是三羧酸循环的中间产物，其水平升高提示三羧酸循环中间产物堆积，说明脾气虚大鼠存在三羧酸循环障碍。这可能是由于一些参与三羧酸循环的酶活性降低或线粒体功能异常。有研究显示，脾虚大鼠琥珀酸脱氢酶的活性较健康大鼠显著降低［3-4］。临床试验发现，脾气虚患者十二指肠细胞线粒体有明显肿胀、变形等形态改变，线粒体DNA序列存在多态性改变［5-6］。脾气虚大鼠的三羧酸循环障碍说明，脾气虚证可能伴随严重的能量代谢异常，从而导致机体能量供应不足和气血运行不畅，进而表现出神疲乏力、肢体倦怠等症状。

3.3.2 糖代谢方面 近代许多医家认为，脾气虚能导致脾失健运引起“脾不散精”，血糖无以调节利用而积蓄，因此糖尿病的发病与脾气虚密切相关［7-8］。本实验结果显示，脾气虚大鼠血清中葡萄糖浓度与健康大鼠比较显著升高，进一步证实脾气虚证可能伴随糖代谢异常从而导致血糖升高。

3.3.3 脂类代谢与健康大鼠比较 脾气虚大鼠亚油酸、亚麻酸、十二碳二烯酸、二十碳二烯酸等不饱和脂肪酸含量显著降低。不饱和脂肪酸能够酯化胆固醇，降低血液中胆固醇和甘油三酯含量，从而降低血液黏稠度，改善血液微循环，调节心脏功能［9-10］。脾气虚大鼠不饱和脂肪酸不足，可能导致血液中低密度脂蛋白和胆固醇含量增加，从而引发动脉粥样硬化或其他心血管疾病。其次，脾气虚大鼠血清中肉毒碱与棕榈酰肉碱含量较健康大鼠显著降低。肉毒碱与棕榈酰肉碱可以转运长链脂肪酸进入线粒体内进行β氧化和三羧酸循环，是脂类代谢中重要的辅助因子［11］。脾气虚大鼠肉毒碱与棕榈酰肉碱缺乏，可能阻碍脂肪酸的氧化代谢，使血脂升高，从而导致动脉粥样硬化或其他心血管疾病。D (-)-β-羟基丁酸是脂肪酸β氧化代谢的一种产物，与健康大鼠比较，脾气虚大鼠血清中D(-)-β-羟基丁酸含量显著降低，进一步证实脾气虚大鼠脂肪酸氧化代谢受阻的结论。以上结果说明，脾气虚证存在脂类代谢紊乱，可能诱发动脉粥样硬化等心血管疾病。

其他代谢方面，与健康大鼠比较脾气虚大鼠瓜氨酸、胸苷、磷酸吡哆醇(参与维生素B6代谢)等小分子代谢物的含量水平显著升高，苯丙氨酸、尿苷、胞嘧啶、维生素A等小分子代谢物的含量水平显著降低，说明脾气虚大鼠还可能存在氨基酸代谢、核苷酸代谢、维生素代谢等其他代谢通路异常。

综上所述，中医脾气虚证与糖代谢、脂类代谢、氨基酸代谢等多种代谢通路异常有关，是机体多个系统功能改变的共同结果。脾气虚证可能伴随机体能量供应障碍，并可能诱发糖尿病及心血管疾病。

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Metabolic spectrum group changes of the serum small molecule on spleen deficiency rat by the application of metabonomics

XU Ying，JIA Lian-qun，DU Ying，ZHEN Bi-xian，YANG Guan-lin△
(Key Laboratory of Ministry of Education for TCM Viscera-State Theory and Applications，Ministry of Education of China (Province-Ministry Co-construct)，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang Liaoning 110847，China)

Objective:To study the changes in the characteristics of serum metabolism in rats with spleen-qi deficiency，in order to investigate the essence of spleen-qi deficiency.Methods:14 male SD SPF rats were randomly assigned into two groups which were the spleen-qi deficiency model group and the normal control group.Each group had 7 rats.Spleen-qi deficiency rat model was established simulating traditional Chinese medicine cause of disease.LC-Q/TOFMS was used to exam the serum samples of the rats.The serum metabolism was compared between the spleen-qi deficiency model group and the normal control group via PCA，PLS-DA and OPLS-DA analysis.Metabolites with levels significantly different between these two groups were identified.Results:There were significant differences in serum metabolism between rats in the spleen-qi deficiency group and those in the normal control group.Levels of some metabolites such as glucose，succinic acid.were significantly increased and those of androsterone，linoleic acid.were significantly decreased in rats with spleen-qi deficiency compared to healthy rats.Conclusion:Rats with spleen-qi deficiency showed different characteristics of serum metabolism compared to healthy rats.Spleen-qi deficiency was accompanied with abnormality in many metabolism systems.It was also associated to insufficient energy supply and may lead to diabetes and some cardiovascular diseases.

Spleen-qi deficiency;Metabonomics;Rats;Serum

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1382-05

2015-03-18

国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(201133CB531700)

△通讯作者:杨关林，Tel:024-31207046，E-mail:yang_ guanlin@163.com。