湿温病“内外相引”的机理研究❋

舒发明，刘业方，黄 英，冯全生，郑秀丽

(成都中医药大学，成都 610075)

湿温病“内外相引”的机理研究❋

舒发明，刘业方，黄 英，冯全生，郑秀丽△

(成都中医药大学，成都 610075)

目的:观察外湿(湿邪)对正常大鼠和脾虚造模大鼠胃肠功能影响的规律及其机制，从分子生物学角度揭示湿邪作用机体产生损伤的机理，探讨湿温病“内外相引”的机理。方法:将40只大鼠按随机数字表法分成空白对照组、外湿组、内湿组、内外兼湿组4组各10只。采用ELISA法检测各组大鼠胃窦生长抑素(SS)、P物质(SP)、血清中胃动素(MTL)及胃泌素(GAS)的变化，HE染色观察胃肠组织病理改变。结果:外湿组、内湿组大鼠胃窦SS、SP、MTL及GAS含量均较空白对照组降低，内外兼湿组显著降低。病理结果显示，外湿组、内湿组、内外兼湿组胃组织均存有不同程度的充血、炎症、糜烂，小肠组织亦发现充血、炎症，内外兼湿组可见轻度糜烂，且小肠组织病理形态改变较胃组织轻。结论:外湿组、内湿组、内外兼湿组均存在大鼠胃肠激素、胃肠病理组织改变，表明湿与脾胃关系密切，而内外兼湿组改变最明显，客观表明“内外相引”为湿温病的重要病机。

湿温;内外相引;生长抑素(SS);胃窦P物质(SP);胃动素(MTL);胃泌素(GAS)

温病学认为，湿温病的发病是由于外湿引动内湿而成，外邪入里，里湿为合，内因脾胃不能运化水谷之湿，外因感受时令之湿导致“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”。因此，本课题拟以外湿对脾虚大鼠胃肠功能的影响为切入点进行湿温病“内外相引”的机制研究，观察外湿(湿邪)对正常大鼠和脾虚造模大鼠胃肠功能影响的规律及其机制，从分子生物学角度揭示湿邪作用机体产生损伤的机理，探讨湿温病“内外相引”的机理。

1 材料

1.1 实验动物

选用健康 SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由成都中医药大学动物实验中心提供(动物合格证号scxk-09-2006)。

1.2 主要试剂与仪器

SP、SS、MTL、GAS放免试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，电子秤(ACS-3H，中山市金利电子衡器有限公司制造)、AvantiTM30型冷冻离心机(BECKMAN)、光学显微镜(Olympus BX43日本)和Mias2001图像分析系统等。

2 方法

2.1 分组

将40只大鼠按随机数字表法分为空白对照组、外湿组、内湿组、内外兼湿组4组，每组各10只。

2.2 造模

参照文献方法进行［1］。外湿组每天定时放入水深25 cm、水温27℃～29℃的水桶中游泳15 min。平时使用加湿器雾化加湿持续7 d，复制外湿模型。内湿组按25 ml/kg剂量在第1、3、5、7天行液态猪油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持续7 d，复制脾虚内湿模型。内外兼湿组每天定时放入水深25 cm、水温27℃ ～29℃的水桶中游泳15 min，游泳完毕后，立即按25 ml/kg剂量在第1、3、5、7天行液态猪油灌胃，第2、4、6天行30%蜂蜜灌胃持续7 d，复制脾虚兼外湿模型。空白对照组不采取任何措施。

2.3 观测指标及检测方法

2.3.1 一般情况观察 每日观察精神、活动、二便、体质量等，定时记录饮食量。

2.3.2 胃和小肠组织病理形态观察 造模后第8天处死动物，取胃和小肠置10%甲醛水溶液中固定，各级浓度脱水、常规石蜡切片、HE染色，光镜下观察形态学改变。

2.3.3 血清MTL、GAS水平测定 ELISA法检测血清胃动素(MTL)和胃泌素(GAS)水平。大鼠腹腔麻醉后，腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，分离血清保存在-20℃ 冰箱中，具体检测按MTL、GAS酶联免疫分析试剂盒说明书进行。

2.3.4 胃窦SS、SP水平测定 胃窦组织匀浆后，ELISA法检测胃窦P物质(SP)和生长抑素(SS)水平。剪取适量胃窦组织称重，按胃窦组织体积与生理盐水体积比1∶5比例，尽快加入生理盐水于匀浆器中碾磨制成匀浆，4℃ 3000 r/min离心15 min，取上清-20℃ 保存备测，具体检测方法按SP、SS酶联免疫分析试剂盒说明书进行。

2.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，各组实验结果差异性检验满足正态性分布采用方差分析，组间两两比较方差齐用LSD法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 模型一般体征的观察结果

造模后，外湿组、内湿组和内外兼湿组大鼠均出现活动明显减少、精神较差、食欲不振、饮食量减少、大便溏、皮毛色泽晦暗发黄、消瘦、腹胀、体质量减轻等症状，脾虚兼外湿组变化最为明显。

3.2 SS、SP、MTL、GAS含量测定结果

表1显示，与空白对照组比较，外湿组大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，内湿组大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量显著降低(P＜0.05)，内外兼湿组以上指标含量降低极为显著(P＜0.01)。与外湿组比较，内湿组大鼠的SS、SP、MTL、GAS含量均显著降低(P＜0.05)，内外兼湿组以上指标降低极显著(P＜0.01)。与内湿组比较，内外兼湿组大鼠的SS、SP、MTL、GAS降低更为显著(P＜0.05)。

表1 各组大鼠SS、SP、MTL、GAS比较(ng/mL，±s)

表1 各组大鼠SS、SP、MTL、GAS比较(ng/mL，±s)

注:与空白对照组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与外湿组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与内湿组比较:▲P＜0.05

组别 鼠数GAS SS SP MTL空 白 对 照 组10 0.31±0.23 0.43±0.520 0.39±0.44 0.61±0.21外 湿 组 10 0.25±0.52 0.22±0.080 0.22±0.06 0.43±0.15内 湿 组 10 0.14±0.04△＊ 0.17±0.054△＊ 0.13±0.03△＊ 0.39±0.18△＊内 外 兼 湿 组 10 0.08±0.30△△＊＊▲ 0.08±0.290△△＊＊▲ 0.09±0.03△△＊＊▲ 0.25±0.17△△＊＊▲

3.3 胃肠组织病理观察

图1、2显示，对外湿、内湿和内外兼湿3种模型组大鼠解剖发现，多数动物胃肠胀气明显，胃内残留食糜较多。HE染色后，普通光学显微镜下观察，空白对照组胃肠组织均无明显改变，外湿、内湿和内外兼湿3种模型组动物胃组织黏膜有不同程度黏膜充血、炎症细胞(淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞)浸润、黏膜灶性糜烂，部分腺体排列欠规则，黏膜腺体破坏，一些细胞呈散在分布处于增生状态(浆多、核大、染色质稀疏)，可见点状、条索状纤维增生，以上胃组织病理变化严重程度按外湿组、脾虚组、内外兼湿组的次序而递增;小肠组织病理形态与胃组织相似，但其充血、炎症程度较胃组织轻，且只有内外兼湿组出现有轻度糜烂，外湿、内湿组均未见糜烂。

4 讨论

中医认为，脾主运化水湿为阴土，喜燥恶湿，对湿邪有特殊的易感性，所以脾具有运湿而恶湿的特性。湿为长夏主气，脾为湿土之脏，湿为土之气，同气相从，故湿与脾土相应易阻滞气机、困阻脾胃，导致脾失健运，出现胃肠消化功能的受损。温病学家薛生白《湿热病》指出，湿温病的发病为“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引，故病湿热”，即外湿引动内湿，以内湿为基础。

中医脾胃主运化的功能包含现代医学胃肠消化吸收的生理过程，消化道的运动除受神经调节外，还受胃肠激素的调节。胃肠激素是一类由胃肠道黏膜层及胰腺内的内分细胞和旁分泌细胞分泌、由胃肠壁的神经末梢所释放的一组小分子高效能生物活性物质［2］，在胃肠运动调节机制中发挥着重要作用。胃肠激素当中P物质是主要的兴奋性神经递质，其能直接作用于环形肌、纵行肌引起收缩，进而促进胃肠蠕动。现代研究表明，P物质调节胃肠蠕动可能是通过其参与消化间期移行性复合运动来实现的［3］。生长抑素有多种分子形式，它几乎对所有的生理性内外分泌反应均有抑制作用［4］，可抑制胃泌素、肠的蠕动等各种胃肠激素的分泌等，故对胃肠黏膜的损伤具有保护作用［5］。胃动素(MTL)则具有强烈刺激上消化道的机械运动和生理性肌电活动的作用，是启动移行性复合运动Ⅲ相的重要启动因子之一［6］，它的主要生理功能为刺激胃和肠的运动及促进胃蛋白酶分泌，参与消化道运动的调节。胃泌素(GAS)则具有刺激胃蛋白酶、胃酸的分泌，使幽门括约肌和胃窦收缩、帮助消化、延缓胃排空等作用［7］。

本实验中，外湿组、内湿组、内外兼湿组大鼠胃肠激素、胃肠病理组织均改变，表明湿邪易伤脾胃，湿邪与脾胃关系密切，外湿组、内湿组、内外兼湿组大鼠胃窦的SP含量降低，导致其不能发挥对胃肠道的兴奋性刺激作用，外湿组、内湿组、内外兼湿组大鼠可能存在胃肠动力不足，这与湿邪困脾所表现的胃脘痞满、纳差呕吐、大便稀溏等临床症状一致。同时外湿组、内湿组、内外兼湿组3种模型组SS的含量也降低，这表明SS对消化系统的抑制作用减弱，其对胃酸、胃蛋白酶等分泌抑制作用解除、胃肠道的保护屏障可能受到破坏。本实验中外湿组、内湿组、内外兼湿组3种模型组MTL、GAS降低，这可能是湿邪释放各种免疫因子使迷走神经兴奋和抑制失调，使MTL和GAS分泌异常。也或因湿邪导致炎症、缺血使胃肠道瘀血、胃肠黏膜细胞分泌MTL失常，而胃扩张减缓、胃窦部压力减轻，可使GAS释放减少。在与空白对照组比较中，脾虚和脾虚兼外湿组变化更为明显，表明湿邪涉及到脏器病变，进而使MTL及GAS代谢水平异常。脾虚兼外湿组SP、SS、MTL以及GAS的含量较外湿组和内湿组降低更为明显，亦说明内外兼湿胃动力受抑制程度、胃肠道保护屏障的破坏程度更严重，从客观上体现了叶天士提出的“外邪入里，里湿为合”、外湿引动内湿的理论，也与薛生白提到的“太阴内伤，湿饮停聚，客邪再至，内外相引”的原理相符，为湿温病“内外相引”的发病特点提供了一定的实验依据，但湿温病“内外相引”的相关调控通路尚待进一步的深入研究。

图1 各组大鼠胃组织切片HE染色结果(HE×200)

图2 各组大鼠小肠组织切片HE染色结果(HE×200)

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Mechanism research of Dampness warm diseases"internal and external leading"

SHU Fa-ming，LIU Ye-fang，HUANG-Ying，FENG Quan-Sheng，ZHENG Xiu-li△
(Chengdu University of Chinese Medicine，Sichuan Chengdu 610075，China)

Objective:To observe the influence of dampness pathogen on gastrointestinal function of normal rats and spleen deficiency rats and investigate the changing rule of gastrointestinal hormones，to approach the mechanism of damage of body from molecular perspective and to investigate internally and externally interattraction.Methods:A total of 40 rats were divided into 4 groups(each group 10 rats)randomly:the normal control group、the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group.The contents of SS、SP、MTT and GAS in sinus ventriculi were detected by radioimmunoassay，gastrointestinal pathologic changes were observed by HE staining.Results:The contents of SS、SP、MTT and GAS in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group were obviously lower than those in the normal control group，with the contents of SS、SP、MTT and GAS in internal and external wet group decreased more.Pathology showed:Gastric tissue models(in the internal wet group、the external wet group、the internal and external wet group)have different levels of congestion、inflammation、erosion，intestinal tissues of model group also found that congestion，inflammation，internal and external interattraction showed mild erosion，and the pathological changes of the latter is lighter than the former.Conclusions:There is the certain disorder of gastrointestinal hormones in sinus ventriculi of rats with internal，external wet and Internal and external wet syndromes，pathological changes were generated from stomach and testine tissue.Wet is related to spleen and stomach.Internal and external interattraction is the important pathogenesis of damp warm diseases.

Damp-warm disease;Internally and externally interattraction;SS;SP;Motilin;Gastrin

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1377-03

2015-04-24

成都中医药大学校基金项目-湿温“内外相引”的机理研究(ZRYB201023)

舒发明(1988-)，男(瑶族)，广西桂林人，医学硕士，从事温病学的临床与研究。

△通讯作者:郑秀丽，女，讲师，从事温病学的临床与研究，Tel:13880937093，E-mail:43726134@qq.com。