肾脏纤维化中的新角色——血管周细胞

钟永忠 谌达程 综述 曾彩虹 审校



·基础医学 ·

肾脏纤维化中的新角色
——血管周细胞

钟永忠 谌达程 综述 曾彩虹 审校

肾脏的周细胞是一种与内皮细胞紧密联系、具有广泛分支且能产生胶原的细胞。正常生理状态下参与维持微血管稳定。在肾脏受到持续损伤后，周细胞从微血管中剥离并转分化成致瘢痕的肌成纤维细胞。抑制周细胞-肌成纤维细胞的转化，能阻止管周毛细血管稀疏化，改善肾脏纤维化。在正常肾脏中周细胞还具有产生促红细胞生成素(EPO)的作用。慢性肾脏病(CKD)患者中，周细胞向肌成纤维细胞转分化后产生EPO能力下降。最近关于肾脏周细胞的研究取得了较大进展，对周细胞功能的研究有助于了解肾脏纤维化的发生机制。针对周细胞的治疗有望成为延缓CKD进展的新靶点。

周细胞 肾脏纤维化 肌成纤维细胞 周细胞-肌成纤维细胞转化

肾脏纤维化是造成终末期肾病(ESRD)的最后共同通路，其病理特点是肌成纤维细胞产生大量的细胞外基质蓄积在间质内。追踪肌成纤维细胞的起源成为过去几十年的研究热点，主要理论之一是上皮细胞间充质转化(EMT)[1-2]。然而该理论越来越受到质疑，原因在于EMT现象主要来源于体外细胞实验，而在活体动物纤维化模型中并未观察到EMT这一现象[3-4]。近期研究表明，周细胞可能是形成肌成纤维细胞的主要祖细胞，周细胞被激活后转分化为肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质，参与肾脏纤维化过程，同时造成微血管稳定性下降[4]。

肾脏周细胞鉴别

对肾脏周细胞的鉴别依然是目前的一大难点。当前最佳方法是将解剖形态学特点、细胞表面分子标志物及基因示踪技术等相结合。

周细胞的形态学特点 对周细胞和血管周围成纤维细胞的定义是根据他们形态结构学特征进行区分[5]。二者均是间充质来源，具有产生胶原能力且高度分支状的间质细胞。嵌入在微血管的基膜内，并且与内皮细胞存在细胞间连接，被称为周细胞；而位于动脉或静脉基膜外侧附近不与内皮细胞直接接触的细胞，被称为血管周围成纤维细胞。周细胞在内皮细胞面含有多个突起，部分突起与内皮细胞的胞质凹陷区存在紧密联系[4]。这种称之为榫-穴样接触的紧密联系有利于内皮细胞与周细胞之间的相互作用(图1)[6]。周细胞在不同的器官中形态存在差异[7]，数量也不一致[8]。在成熟的组织中，电镜被认为是鉴别周细胞的重要手段[8]。

图1 周细胞模式图

周细胞拥有长突起，部分突起被毛细血管基膜包绕，未被包绕的部分突起与内皮细胞之间存在直接的细胞之间接触，比如榫-穴样接触[9]。

周细胞的表面标记物 周细胞表面分子标志物不仅在不同器官中表达不同，而且在周细胞不同发育阶段表达也不同。此外，某些分子标记物在周细胞上表达特异性也不高。如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，表达于平滑肌细胞系及肌成纤维细胞，常用于视网膜周细胞的标记，但成人健康肾脏周细胞中α-SMA表达水平却很低[4]。虽然神经元-神经胶质抗原2(NG2)(一种硫酸软骨素蛋白多糖)在新生肾脏周细胞高表达，但在发育成熟的肾脏周细胞中表达很少。有趣的是，肾脏受损伤时，周细胞被激活后重新表达NG2。周细胞的其他分子标志物，如血小板源性生长因子受体β(platelet derived growth factor receptor-β，PDGFRβ)、结蛋白、中间丝波形蛋白、CD73等分子标志物单独使用时均无法准确、特异的标记周细胞[10]。因此联合多种标志物有利于更准确鉴别周细胞。目前认为发育成熟的肾脏周细胞来源于表达Foxd1的祖细胞，并且Ⅰ型胶原α1(Col 1 α1)、血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)、和CD73染色阳性，而α-SMA和CD45染色阴性。

基因谱系示踪技术鉴别周细胞 利用标记有绿色荧光蛋白的Col 1 α1-GFP的转基因小鼠标记能产生Ⅰ型胶原的细胞，Col 1 α1-GFP阳性细胞包括周细胞、血管周成纤维细胞、肾小球足细胞，而系膜细胞及血管平滑肌细胞呈阴性[4]。或者将Foxd1cre/+的小鼠与带有tdTomato报告蛋白的小鼠交配，得到Foxd1cre/+;Rosa 26fstdTomato/+小鼠，Foxd1来源的间充质细胞将获得番茄红自发荧光，这些细胞将发育为周细胞、血管周成纤维细胞、血管平滑肌细胞和系膜细胞，但不包括内皮细胞[3]。这两种标记物的结合可有效地将周细胞、血管周围成纤维细胞与其他细胞分辨出来，但还需结合与内皮细胞的关系才能进一步的辨别。

周细胞的生理功能

周细胞最重要的作用是促进血管的发育与维持血管的稳定。在血管形成过程中，PDGFB/PDGFRβ和Angiopoietin-1/Tie2等信号通路参与周细胞的分化、招募过程；而转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、Notch等与调节新生血管的稳定性有关[10]。血管成熟的一个重要特点是招募周细胞至血管周围从而稳定新生血管，如果周细胞的招募和维持缺陷将导致病理性状态的发生，如微血管瘤。此外，周细胞还具有调节微血管张力、合成基质蛋白、维持局部组织的稳态、参与免疫防御反应、干预凝血反应等功能[7]。最近研究还发现周细胞可能是肾脏内产生促红细胞生成素(EPO)的主要细胞[11]。

微血管周细胞在肾脏纤维化中的作用

无论何种原因所致的肾脏损伤，ESRD最终的病理改变都是肾脏纤维化[12]。肾脏纤维化的组织学特点是炎症细胞、肌成纤维细胞浸润，细胞外基质沉积、肾小管萎缩和管周毛细血管稀疏化[13]。肌成纤维细胞是产生病理性胶原沉积的主要细胞，但其来源一直存在较大的争议。

肌成纤维细胞的主要来源 对于肌成纤维细胞来源的争议主要源于缺乏有效鉴别成纤维细胞和肌成纤维细胞的标志物。关于肌成纤维细胞来源的理论包括： EMT、固有成纤维细胞细胞的增殖、循环中的成纤维细胞侵入及内皮细胞间充质细胞转分化(endothlial-mesenchymal transition，EndoMT)等[14]。

早期研究主要利用S100A4蛋白(成纤维细胞特异性蛋白-1)来标记成纤维细胞发现，EMT和骨髓来源的成纤维细胞是肾脏肌成纤维细胞的主要来源，消融S100A4阳性的细胞能够改善肾脏纤维化[1]。然而，随后的研究表明S100A4更有可能是巨噬细胞的标志物，消融S100A4阳性细胞可能是消融了巨噬细胞[15]。随着基因谱系示踪技术在肾脏中的应用[16]，使得追踪肌成纤维细胞的来源成为了可能。Lin等[4]发现肾脏周细胞来源于肾脏发育过程中Foxd1+的祖细胞，在肾脏纤维化损伤中分化成肌成纤维细胞，但未发现Six2(一种转录因子，阳性细胞主要分化成肾小管上皮细胞)或者HoxB7(一种转录因子，阳性细胞主要分化成集合管和输尿管上皮细胞)来源的细胞向肌成纤维细胞转分化[3]。其他研究团队的结果也显示在肾脏纤维化过程中损伤的上皮细胞并不存在EMT[17-18]。然而LeBleu等[19]利用多基因工程鼠来追踪和确定肾脏纤维化中肌成纤维细胞的来源，发现50%的肾脏肌成纤维细胞由肾脏固有肌成纤维细胞增殖而来，周细胞、EMT并不是肌成纤维细胞的主要来源。

以上体内实验表明，周细胞可能是肾脏肌成纤维细胞的主要来源。循环纤维细胞、EMT和EndoMT的作用虽然不能完全排除，但尚不确切。在皮肤、肝脏、神经、肺等组织损伤后修复过程中，周细胞也被认为是致瘢痕性肌成纤维细胞的重要来源[20]。

促进管周毛细血管稀疏化的发生 在中枢神经系统，周细胞在调节微血管稳定性的作用已经很明确，如血脑屏障、视网膜-血液屏障等[21-23]。关于肾脏周细胞血管稳定性方面的作用才刚开始研究。

Lin等[24]对单侧输尿管结扎(UUO)大鼠肾损伤模型中周细胞和内皮细胞之间的关系进行了观察。肾损伤1 d时出现周细胞从毛细血管上分离、迁移至间质，第2天，分离的周细胞数量及位置类似于血管形成的早期反应，主要表现肾脏微脉管系统内毛细血管密度增加，这一血管形成反应一直持续到第7天。如果损伤继续持续到第10天，微脉管系统开始变得稀疏化。为了阐明VEGF-A和PDGF在肾脏周细胞剥离和周细胞-肌成纤维细胞转分化中的意义，作者给小鼠注射可溶性PDGFRβ(sPDGFRβ)和可溶性VEGF受体2(sVEGFR2)(分别是PDGFRβ或者VEGFR2的外部功能区)，阻断内皮细胞和周细胞内PDGFRβ或者 VEGFR2的信号转导后可减少周细胞的剥离，增加周细胞数量、抑制其转分化为肌成纤维细胞。阻断PDGFRβ或VEGFR2能减轻UUO大鼠第14天的毛细血管稀疏化。提示PDGFRβ和VEGFR2参与了周细胞从内皮细胞剥离的信号传导、肌成纤维细胞转分化从而在毛细血管稀疏化发展中的作用。Greenberg等[25]也观察到类似的现象，VEGF-A以PDGFRβ依赖的方式促进了周细胞的剥离和血管的不稳定性。阻断VEGFR2后暴露于VEGF-A和PDGF可重建血管生成。此外，肾脏损伤后，肾脏周细胞-肌成纤维细胞的转化伴随着VEGF-A亚型的转变，由VEGF164转变成血管生成抑制因子VEGF120和VEGF188，VEGF164是VEGF-A的主要亚型，表达于肾脏周细胞，而肌成纤维细胞主要表达VEGF120和VEGF188。VEGF120和VEGF188的高表达可引起肾脏微血管稀疏化。在小鼠胚胎发育过程中，周细胞和内皮细胞内EphrinB4受体(EphB4)和EphrinB2 配体之间的双向信号对于血管形成及稳定非常重要。EphB4和EphrinB2均属于膜结合型蛋白，在自身活化和信号转导方面表现出独特的方式。一方面，活化依赖细胞间近距离接触；另一方面，信号转导途径是双向的，在信号转导过程中二者均可被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”。以EphrinB2为配体激活EphB4，引起受体自身磷酸化，进而激活下游的信号转导级联反应，此为正向信号；以EphB4为配体结合EphrinB2后，快速募集Src家族激酶到EphrinB2附近，将EphrinB2酪氨酸残基磷酸化，然后与接头蛋白Grb4的SH2结构域相结合，激活下游信号通路，此信号为反向信号。Kida等[26]证明在肾脏损伤后，EphrinB2的反向信号被激活，促进血管新生；缺乏EphrinB2细胞内的PDZ信号区域的大鼠，可引起血管形成受损，加重血管稀疏化及肾脏纤维化。该研究表明肾脏周细胞和内皮细胞内EphB4 和EphrinB2的双向信号对维持血管的稳定性非常重要，反向信号的缺乏将加速肾脏纤维化。

最近的3D凝胶技术也证实了肾脏微血管周细胞具有稳定毛细血管腔的作用[可能是通过分泌VEGF-A、血管生成素1和组织金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)][27]。UUO模型出现肾脏损伤后，肾脏周细胞可快速激活含凝血酶敏感蛋白模体的去解联金属蛋白酶1(ADAMTS-1)和下调ADAMTS-1的抑制剂基质金属蛋白酶的组织抑制剂3(TIMP3)，降低毛细血管的稳定性。而且TIMP3缺陷小鼠由于周细胞的过度激活，在外界损伤刺激下，更容易造成微血管稀疏化，纤维化反应更加剧烈。

总之，周细胞在微血管稳定方面发挥着巨大作用。周细胞向肌成纤维细胞的转分化与周细胞的剥离、微血管的稀疏化相关。VEGF-A中抗血管生成亚型的集聚、ADAMTS-1的上调及TIMP3的下调可能是造成血管重塑的机制之一。PDGFRβ和 VEGFR2的阻断可改善病理性的周细胞-肌成纤维细胞转化，减少微血管稀疏化。

EPO产生减少 在成年人中，EPO主要合成于肾脏，作用于骨髓中的红细胞系祖细胞，刺激红细胞生成。在贫血和缺氧条件下，通过诱导缺氧诱导因子2α(HIF-2α)表达刺激EPO的产生。然而，在慢性肾脏病(CKD)晚期，尽管出现严重贫血，但是EPO的水平却不能上调。

利用EPO启动子GFP的转基因鼠，证实能产生EPO的肾脏细胞可能是肾皮质和外髓的肾小管周围成纤维细胞[28-29]。这些产生EPO的细胞拥有独特的星型形状，伸出许多的足突，位于毛细血管内皮细胞和肾小管上皮细胞之间，可表达PDGFRβ、CD73、微管相关蛋白2和神经丝轻链多肽，但是不表达CD31[28]。基于形态学、结构学及细胞表面标志物的上述特点，认为这些产生EPO的细胞可能是肾脏周细胞。Asada等[30]用髓鞘蛋白零Cre重组酶(P0-Cre)谱系标记肾脏成纤维细胞发现，P0-Cre来源的成纤维细胞同时拥有产生EPO和在肾脏损伤后分化成肌成纤维细胞的能力，且伴产生EPO的能力降低。P0-Cre来源的成纤维细胞位于后肾间充质的生肾间充质区域，之后移行至肾脏间质内，这和Foxd1+间充质祖细胞所标记区域一致。因此，管周毛细血管内皮细胞外的Foxd1+来源、Col1α1-GFP+的周细胞拥有产生EPO的潜能。

肾脏疾病患者EPO产生不足的机制目前依然不完全清楚，可能与氧感受机制的紊乱及EPO产生能力的破坏有关。缺氧诱导因子(HIF)系统是最重要的氧感应系统，在缺氧情况下，HIF作为一个DNA结合转录因子被激活。在正常氧分压状态下，脯氨酰羟化酶域酶(PHD)可将HIF快速降解。目前Ⅰ期临床试验对口服PHD抑制剂FG-2216的有效性进行研究发现，在血液透析患者和健康人群中FG-2216具有不依赖于低氧而稳定HIF的效果，使血液透析患者EPO水平升高约30倍，从侧面说明在纤维化的肾脏中产EPO细胞并未完全丢失。CKD患者在肾组织缺氧及贫血状态下产生EPO能力减少或不足的具体机制目前仍不清楚。Bechtel等[31]研究表明编码Ras癌蛋白抑制剂的RASAL1基因高度甲基化，造成了肾脏纤维化的持续进展。而这些表观遗传学变化是由DNA甲基转移酶1介导的，该酶在纤维化肾脏中的许多成纤维细胞上表达上调。周细胞转变成肌纤维细胞后，细胞内的DNA甲基转移酶1表达增加，可能是导致EPO产生不足的原因，但尚需进一步的研究来证实。如果假设得到证实，则DNA去甲基化药物有望成为逆转CKD患者EPO产生减少的药物之一。

小结：传统观点认为，致纤维化的肌成纤维细胞主要来源于肾小管上皮细胞转分化，而最近的研究表明，血管周细胞在许多器官组织的纤维化过程中发挥着重要作用，其中也包括肾脏。静息状态下健康肾脏的周细胞维持着微血管的稳定性。肾脏损伤时，周细胞的剥离、增殖和向肌成纤维细胞转分化，不但使微血管稳定性下降，造成肾小管间质慢性缺氧，同时转分化而来的肌成纤维细胞造成病理性细胞外基质蓄积。周细胞在转分化为肌成纤维细胞后，产生EPO的能力也相应降低。在肾脏纤维化形成中，周细胞和它相邻的内皮细胞或肾小管上皮细胞之间的信号传导在周细胞的剥离及转分化中发挥重要作用的。阻断PDGF、VEGF-A、TGF-β或者Wnt信号通路已经被证明可减少周细胞-肌成纤维细胞转分化，减轻毛细血管稀疏化，减少炎症细胞浸润和改善肾脏纤维化。因此，针对周细胞在肾脏纤维化中的作用，有助于为抗纤维化药物及CKD患者贫血治疗药物的研发提供新思路。

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(本文编辑 心 平)

A novel contributor to renal fibrosis——microvascular pericyte

ZHONGYongzhong,CHENDacheng,ZENGCaihong

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

In the kidney,microvascular pericytes are extensively branched,collagen-producing cells in close contact with endothelial cells.These cells contribute to the stability of microvascular in physiological condition.After continuous renal injury,the pericytes detach from the basement of capillaries and transform to scar-forming myofibroblasts.Inhibit pericyte-myofibroblasts transforming improve the renal fibrosis and peritubular capillary rarefaction.Additionally,the pericyte may be the major erythropoietin-producing cell in the kidney.In the patients of chronic kidney disease,transforming to myofibroblast make the pericyte effectiveless in producing the erythropoietin although the marked anemia.The research about the pericyte in kidney has made great process in recent years.Learning about the function of pericyte help us to understand the mechanism of renal fibrosis.Furthermore,the therapy targeting the pericyte may be helpful in preventing the progress of renal fibrosis.

pericyte renal fibrosis myofibroblast pericyte-myofibroblast transition

南京军区南京总医院肾脏科 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2014-12-20