荣骨定痛膏的镇痛抗炎作用及其机制*

刘晓霞， 王志旺△， 陈小平， 刘彩民， 妥海燕

(1． 甘肃中医学院， 兰州 730000; 2． 甘肃省靖远县中医院，靖远 730600)



荣骨定痛膏的镇痛抗炎作用及其机制*

刘晓霞1， 王志旺1△， 陈小平2△， 刘彩民2， 妥海燕1

(1． 甘肃中医学院， 兰州 730000; 2． 甘肃省靖远县中医院，靖远 730600)

目的：研究荣骨定痛膏镇痛、抗炎作用及其机制。方法：采用热板法、醋酸扭体法来观测荣骨定痛膏的镇痛作用，采用耳廓肿胀法、足肿胀法来考察荣骨定痛膏的抗炎作用，测定渗出液中总蛋白与白三烯B4(LTB4)来研究荣骨定痛膏的抗炎机制。在给药的基础上观测痛阈值、肿胀度等指标；复制气囊滑膜炎，取小鼠66只，随机分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(扶他林0.8 mg/d)、荣骨定痛膏低、中、高剂量组(荣骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)进行实验。结果：30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d的荣骨定痛膏可明显提高小鼠热板痛阈延长百分率、延长扭体潜伏期并减少15 min内的扭体次数，缓解小鼠耳廓肿胀度与足肿胀度(P<0.05,P<0.01)，显示出一定的抗炎、镇痛作用。对气囊滑膜炎模型动物，30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d荣骨定痛膏可降低渗出物中总蛋白及LTB4的含量(P<0.05,P<0.01)。结论：荣骨定痛膏具有一定的镇痛抗炎作用，抑制LTB4的合成是其抗炎机制之一。

荣骨定痛膏；镇痛；抗炎；白三烯B4；小鼠

骨性关节炎(osteoarthritis, OA)是一种慢性进行性骨关节疾病，属于老年临床常见疾病，严重影响了病人的生活质量。临床上常用解热镇痛抗炎药等药物来缓解疼痛症状，而激素虽然疗效好，但长期使用存在严重的不良反应，目前尚缺乏安全有效的治疗措施；在缓解疼痛、改善关节功能等方面，作为非手术疗法的中医药日益受到人们的重视[1]。骨性关节炎属于中医“痹证”的范畴，多因肾气亏虚、关

节失养，复受风寒湿邪，气血痹阻，经络不畅所致，治则应补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛。基于上述中医药理论指导下形成的荣骨定痛膏在临床上取得了较好的疗效。本次研究设计了热板法、扭体法、耳廓肿胀法、足肿胀法以及气囊滑膜炎动物模型，观察荣骨定痛膏镇痛抗炎作用1及对炎症介质的影响，探讨荣骨定痛膏的镇痛抗炎作用及其机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

荣骨定痛膏，由甘肃省靖远县中医院提供，批号：20140415。扶他林乳胶剂(Voltaren gel)，批准文号：国药准字H19990291，北京诺华制药有限公司生产，生产批号：每支20 g乳胶剂中含双氯酚酸二乙胺0.2 g(以双氯酚酸钠计)。白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)、考马斯亮蓝蛋白试剂盒，上海瑞齐生物科技有限公司生产，生产批号：20140601、20140605；醋酸、甲醛、二甲苯等试剂为分析纯。

1.2 动物

SPF级昆明小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g，由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物质量合格证号SCXK(甘)2011-0001。

1.3 仪器

HH-S型恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司生产；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂生产；722型分光光度计，上海第三分析仪器厂产品；BS1103型Sartorius电子天平，北京赛多利斯天平有限公司生产。

1.4 方法

1.4.1 小鼠热板致痛的测定 将雌性小鼠放于55℃±0.5℃的恒温热板上，以从放于热板之上到舔后足的时间为痛阈值，选取痛阈值在5～30 s的小鼠进行实验。取55只小鼠按体重随机分为5组，即正常对照组、阳性对照组(扶他林0.8 mg/d)、荣骨定痛膏低、中、高剂量组(荣骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)，于双后足涂抹40 μl高、中、低浓度荣骨定痛膏或扶他林，正常对照组涂抹等量生理盐水，6 h后再给药1次，共给药2次，末次给药后测定30、60、90 min小鼠的痛阈值。若60 s仍无反应者应立即将小鼠取出并按60 s计算。

1.4.2 醋酸致小鼠扭体反应的测定 取55只小鼠，按性别体重分层随机分为5组(n=11)：即正常对照组、阳性对照组(扶他林0.8 mg/d)、荣骨定痛膏低、中、高剂量组(荣骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)。小鼠腹部脱毛(3 cm×3 cm)，在脱毛区涂抹40 μl高、中、低浓度荣骨定痛膏或扶他林，正常对照组涂抹等量生理盐水，每天2次，连续3 d。末次涂药1.5 h后，各组小鼠分别ip 0.7%醋酸溶液0.2 ml，观察小鼠扭体潜伏期(从注射醋酸到出现第1次扭体的时间)及15 min内出现的扭体次数。

1.4.3 二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的测定 动物分组及给药剂量同1.4.2项下。各组分别于右耳廓两侧涂抹40 μl高、中、低浓度荣骨定痛膏药液或扶他林，正常对照组涂抹等量生理盐水。给药后1 h于每鼠右耳两侧均匀涂抹二甲苯50 μl致炎，30 min后处死动物，用直径8 mm的打孔器于小鼠两耳相同部位打下耳片，称重，计算小鼠耳肿胀度。

1.4.4 甲醛所致小鼠足肿胀的测定[2, 3]动物、分组及给药剂量同1.4.2。各组分别在右足趾涂抹40 μl高、中、低浓度荣骨定痛膏药液或扶他林，正常对照组涂抹等量生理盐水，6 h后再给药1次，共给药2次。给药后于每鼠右后足足垫皮下注射5%甲醛15 μl，致炎4 h后处死动物，在小鼠后足同一部位处剪下左右后足，称重，计算小鼠足肿胀度。

1.4.5 小鼠气囊滑膜炎渗出物中蛋白及LTB4的测定[4]将雄性小鼠背部脱毛(3 cm×3 cm)，脱毛区下方sc过滤空气10 ml，后续实验过程中每天补充注射空气，使小鼠背部脱毛区下方的气囊维持在第1次注射后的大小。第3天小鼠按体重分层随机分为6组(n=11)：即正常对照组、模型对照组、阳性对照组(扶他林0.8 mg/d)、荣骨定痛膏低、中、高剂量组(荣骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)。在脱毛区涂抹40 μl高、中、低浓度荣骨定痛膏或扶他林，正常对照组与模型对照组涂抹等量生理盐水，每天2次，连续3 d。第4天给药后每只小鼠背部气囊注射含1%甲醛的生理盐水0.2 ml，正常对照组注射等量生理盐水。致炎24 h，末次涂药3 h后，用2%戊巴比妥钠ip麻醉小鼠，取Hank's液1 ml灌洗气囊，3 000 r/min离心灌洗液10 min，取上清液按试剂盒说明书测定渗出液中总蛋白与LTB4的含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 荣骨定痛膏对小鼠热板致痛的影响

荣骨定痛膏低、中、高剂量组能明显延长小鼠热板痛阈延长百分率，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表1)；与荣骨定痛膏低剂量组比较，荣骨定痛膏高剂量组在60 min、90 min的痛阈延长百分率有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，显示出一定的量效关系。

2.2 荣骨定痛膏对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

荣骨定痛膏低、中、高剂量组小鼠的扭体潜伏期明显延长、15 min内的扭体次数明显减少，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.05,P<0.01)；同时，与荣骨定痛膏低剂量组比较，荣骨定痛膏中、高剂量组的镇痛作用更强(P<0.05,P<0.01,表1)，显示出一定的量效关系。

Tab. 1 Analgesic effect of RGDT Plaster on hot plate test and acetic acid writhing in mice ±s, n=11)

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose of RGDT plaster

2.3 荣骨定痛膏对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

实验结果显示，荣骨定痛膏低、中、高剂量组可明显缓解二甲苯所致小鼠耳廓肿胀程度，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表2)。

2.4 荣骨定痛膏对甲醛所致小鼠足肿胀的影响

荣骨定痛膏低、中、高剂量组小鼠足肿胀度明显降低，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Anti-inflammatory effect of RGDT plaster on auricle and food swelling in mice ±s, n=11)

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster

**P<0.01vscontrol group

2.5 荣骨定痛膏对小鼠气囊滑膜炎渗出物中总蛋白及LTB4的影响

实验结果显示，小鼠背部气囊注射甲醛后，渗出物中的总蛋白及其中LTB4的含量显著升高，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01，表3)。经荣骨定痛膏干预后，总蛋白及LTB4的含量明显下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.01)；同时，30～120 mg/d的荣骨定痛膏对渗出物中总蛋白及LTB4的影响有一定的量效关系。

GroupDose(mg/d)Totalprotein(mg/mL)LTB4(ng/mL)Control-3.18±0.7620.04±3.08Model-10.83±1.65**100.97±15.46**Voltarengel0.86.61±1.01##103.54±16.44Low308.69±1.35##83.10±13.36##Middle607.14±1.16##△△72.16±12.39##High1206.35±0.96##△△62.05±10.38##△△

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster; LTB4: Leukotriene B4

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vslow dose of RGDT plaster

3 讨论

骨性关节炎(osteoarthritis, OA)也称骨关节病、退行性关节炎等，好发于膝关节、髋关节、脊柱及手指等部位，是一种多发于老年人的慢性进行性骨关节疾病。随着社会进入老龄化，该病发病率逐年增加。据统计，美、英等西欧国家有5%～10%的成年人患有膝关节炎，此病与心血管疾病、创伤并列前三位，每年需手术治疗者达几十万人，由此产生的社会经济负担对社会经济发展有很大影响[5]；随着我国社会人口结构的迅速老龄化，本病不仅是公共卫生问题，而且也成为社会问题，日益引起人们的重视。因此，防治OA已成为各国骨科学界的重要课题。OA的发病机制非常复杂，但其基本病理变化为关节软骨的退行性变与关节的增生性改变(特别是软骨周围及滑膜处)。目前临床上尚缺乏有效的根治措施，治疗的目的是缓解关节疼痛，改善功能并促进重建受损的软骨及骨结构；由于手术治疗缺乏确切有效的临床治疗方案，使得病程明显延长；作为非手术疗法的中医中药日益受到人们的重视[6]。骨性关节炎属于中医“痹证”的范畴。中医理论认为，OA多因年老肾气亏虚，关节失养，局部劳损癖阻；复受风寒湿邪，经络不畅，气血痹阻，关节寒凝、痰阻，不通则痛，故治疗应补益肝肾、活血通络、祛风散寒、胜湿止痛。在此基础上拟定的荣骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、当归、秦艽、独活、川乌等四十余味中草药组成，在靖远县中医院临床使用取得了比较好的疗效。

本次研究通过动物实验来考察荣骨定痛膏的镇痛、抗炎作用。实验结果显示，荣骨定痛膏可明显提高小鼠热板痛阈延长百分率，延长扭体潜伏期、减少15 min内的扭体次数，提示荣骨定痛膏具有确切的镇痛作用；实验显示荣骨定痛膏可明显缓解二甲苯所致小鼠耳廓肿胀与甲醛所致足肿胀，提示荣骨定痛膏具有确切的抗炎作用。炎症是炎症介质引起的局部红、肿、热、痛并伴有全身反应的综合症，白三烯(leukotrienes, LTS)是花生四烯酸在5-脂氧合酶催化下生成的常见炎症介质，包括白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)与白三烯D4(LTD4)等[7, 8]。实验结果显示，荣骨定痛膏可降低小鼠气囊滑膜炎性渗出物中总蛋白及LTB4的含量，提示抑制炎症介质LTB4的合成是荣骨定痛膏抗炎的机制之一。

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The antalgic and antiphlogistic function and mechanism of RGDT plaster

LIU Xiao-xia1， WANG Zhi-wang1△， CHEN Xiao-ping2△， LIU Cai-min2， TUO Hai-yan1

(1. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Traditional Chinese Medicine Hospital of Jingyuan Country in Gansu Province, Jingyuan 730600, China)

Objective: To study the antalgic and antiphlogistic functions and mechanism of ronggudingtong (RGDT) plaster(traditional Chinese medicine). Methods: The painful models were established with hot plate test or acetic acid writhing and the inflammatory models were established with daubing dimethylbenzene on auricle or injecting formaldehyde in toe or synovial envelope to study the antalgic and antiphlogistic functions of RGDT Plaster. The total protein and leukotriene B4(LTB4) in inflammatory exudate were detected to investigate the antalgic and antiphlogistic mechanism of RGDT plaster. The mice were randomly divided into different groups(n=11),on the basis of drug using，the indexes of pain threshold, swelling degree were observed. Sixty-six mice were used to establish gasbag synovitis model and randomly divided into normal control group，model control group，positive control group(Voltaren gel 0.8 mg/d)and low/medium/high dosage RGDT plaster treating groups(30 mg/d,60 mg/d, 120 mg/d). Results: 30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d RGDT plaster could upgrade the pain thresholds, remit auricular and foot swelling(P<0.05,P<0.01), and degrade total protein and LTB4in inflammatory exudates(P<0.05,P<0.01). Conclusion: RGDT plaster has some antalgic and antiphlogistic functions, and one of the mechanisms is depressing synthesis of LTB4.

ronggudingtong plaster (RGDT plaster); analgesia; anti-inflammatory; LTB4; mice

甘肃省中医药管理局科研课题基金项目(GZK-2013-38)

2015-01-23 【修回日期】2015-06-15

R285.5

A

1000-6834(2015)05-462-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.020

△【通讯作者】Tel: 0931-8765395； E-mail: wzw0933@126.com