金叶女贞果实花青素抗炎镇痛的作用机制*

王 静， 王建安， 姜玉新， 周萍萍， 王海华Δ

(1. 皖南医学院生理教研室， 芜湖 241002； 2. 济宁医学院药学院， 山东 日照 276826)



金叶女贞果实花青素抗炎镇痛的作用机制*

王 静1， 王建安2， 姜玉新1， 周萍萍1， 王海华1Δ

(1. 皖南医学院生理教研室， 芜湖 241002； 2. 济宁医学院药学院， 山东 日照 276826)

目的：研究金叶女贞果实花青素抗炎镇痛的作用，为进一步开发新药提供理论依据。方法：实验动物共240只，分为6项实验，每项实验40只，分为5组(n=8)：生理盐水对照组，阿司匹林对照组，花青素高、中、低剂量组。通过小鼠热板法和醋酸扭体法观察花青素镇痛作用；通过二甲苯至耳廓肿胀法、腹腔毛细血管通透性及棉球肉芽肿实验观察花青素的抗炎作用。测定小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、总抗氧化能力(T-AOC)和前列腺素E2(PGE2)水平和小鼠肝脏匀浆的SOD、T-AOC 及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)酶活力，观察肝脏组织学变化。结果：中、高浓度的花青素能提高小鼠痛阈，减少扭体次数；花青素处理组小鼠血清SOD活性增高，NO和PGE2含量降低。高浓度花青素可抑制小鼠耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性的增加和肉芽肿增生，同时提高血清SOD和T-AOC活性，降低血清PGE2含量。肝脏SOD、T-AOC、GSH-PX酶活力有所提高，肝脏组织学切片在各组中未见明显变化。结论：金叶女贞果实花青素具有抗炎镇痛作用，其机制可能与提高小鼠抗氧化能力，减少NO和炎性因子PGE2的生成有关，在实验浓度范围内连续给药7 d对肝脏无明显损伤作用。

金叶女贞；花青素；抗炎；镇痛；小鼠

花青素是一类广泛存在于高等植物的果实、花、茎等器官中的黄酮类化合物， 已有研究发现花青素具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老、抗癌作用以及对肝脏、心脑血管和视力具有保护作用[1-3]；但是花青素的镇痛作用少有报道。而炎症与疼痛常是相伴而行，花青素是否在发挥抗炎作用的同时起到镇痛的作用值得思考。目前用于食品添加及药用研究的天然花青素主要集中于蓝莓、葡萄籽、紫薯等[4-7]。金叶女贞(ligustrum vicaryi )为木犀科女贞属半绿小灌木，被誉为“金玉满堂”，其核果呈紫黑色，含丰富的天然色素——花青素，是极具有开发价值的天然色素资源[8, 9]。本研究拟用金叶女贞果实花青素来探索花青素的抗炎镇痛作用，并观察用药期间是否对肝脏产生毒副作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级昆明小鼠240只，6～8周龄，体重18～22 g，购于苏州爱尔麦特科技有限公司(许可证号：SCXK苏2009-0001)，共分为6项实验，每项实验40只，随机分为5组(n=8)：每天早晨8∶00～9∶00对各组小鼠灌胃给药，给予0.2 ml花青素(90 mg/kg、30 mg/kg及10 mg/kg)分别为花青素高浓度组(high-concentration anthocyanin group, HA)；花青素中浓度组(medium-concentration anthocyanin group, MA)及花青素低浓度组(low-concentration anthocyanin group, LA)，阿司匹林组对照组(aspirin control group, Asp)0.2 ml阿司匹林(100 mg/kg)小鼠灌胃，生理盐水对照组(normal saline control group, NS)小鼠灌胃0.2 ml生理盐水，其他步骤相同，连续7 d。

1.2 主要仪器与试剂

YLB-6B 小鼠热板仪(成都泰盟科技有限公司)，紫外分光光度计(UV-3200PCS)，Model-680型酶标仪(美国BIO-RAD公司)。阿司匹林为AstraZeneca公司产品(批号：1304031)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物科技公司。

1.3 花青素的提取与纯化

取金叶女贞果实于50℃烘箱中干燥至恒重，粉碎过80目筛，以75%的乙醇提取，提取液抽滤以除去滤渣得粗提液，粗提液经DM130大孔树脂柱进行吸附，待吸附完全，以蒸馏水冲柱和石油醚萃取以除去树脂柱中的糖和脂类，即得去糖去脂花青素。将去糖去脂花青素溶液置于冻干机中冻干，最后得到纯花青素粉末，使用时溶于生理盐水中。

1.4 花青素的镇痛作用

1.4.1 热板法镇痛实验 为避免雄性小鼠阴囊热板引起刺激反应，故取雌性实验小鼠，置于55℃±0.5℃智能热板仪的金属板上，测定各鼠从放在金属板上至出现舔后足所需时间(s)作为该鼠的基础痛阈值(测量2次取平均痛阈)，选取基础痛阈在(5～30)s的40只雌鼠参加试验，每组8只，分组如上1.1。末次给药后分别在给药后15 min、30 min、60 min、120 min、 240 min测小鼠痛阈。实验结束后眼眶取血，3 000 r/min离心10 min，取血清检测NO和PGE2含量及SOD活性。

1.4.2 醋酸扭体法镇痛实验 实验小鼠40只，雌雄各半，每组8只，分组及给药同1.1。末次给药后1 h，腹腔注射新鲜配制的0.8%冰醋酸溶液0.2 ml，观察小鼠产生“扭体”反应次数，以小鼠腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起、后肢伸长等行为反射为1次完整扭体反应。观察15 min内扭体次数，计算扭体反应抑制率。抑制率(%) = (对照组扭体数-给药组扭体数)/对照组扭体数×100%。

1.5 花青素的抗炎作用

1.5.1 小鼠腹腔毛细血管通透性实验 实验小鼠40只，雌雄各半，每组8只，分组及给药同1.1。末次给药后30 min，各小鼠尾静脉注射质量浓度0.5%的伊文思兰溶液0.2 ml，随即腹腔注射质量浓度0.6%的醋酸溶液0.2 ml，20 min后脱颈处死，剪开腹部皮肤肌肉，用6 ml生理盐水分3次洗涤腹腔，最后合并洗液使总量达5 ml，将洗液3 000 r/min离心15 min，取上清液于590 nm测定OD值。

1.5.2 小鼠棉球肉芽肿实验 实验小鼠40只，雌雄各半，每组8只。乙醚麻醉小鼠，在小鼠的背部正中央去毛并用75%的乙醇消毒，然后用手术剪刀开0.5 cm 长的小口，用眼科镊子将质量为10 mg的灭菌棉球从小切口植入皮下，并在切口上撒适量的青霉素以防止伤口感染，之后用手术针缝合小鼠皮肤。然后随机分成5组，给药同上1.1。手术当天开始，灌胃给药连续7 d。末次给药后5 h眼眶取血，3 000 r/min离心10 min，比色法检测各组小鼠血清中SOD活性和NO含量，ELISA法检测血清PGE2含量。用剪刀和镊子打开原切口，将棉球连同周围结缔增生组织一起取出，剔除脂肪组织，放人烘箱中80℃烘干2 h，称质量。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿的质量。抑制率(%) = (对照组肉芽肿质量-给药组肉芽肿质量)/对照组肉芽肿质量×100%。

1.5.3 二甲苯至小鼠耳廓肿胀实验 实验小鼠40只，雌雄各半，每组8只，分组及给药同1.1。末次给药后1 h，将40 μl二甲苯均匀涂于小鼠右耳两侧，至炎1 h后脱锥处死，沿耳廓基线剪下双耳，用打孔器在左、右两耳同一位置打下圆耳片，称重，以左右耳片重量差为肿胀度。肿胀抑制率%=(对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/对照组平均肿胀度×100%

1.6 花青素对肝脏功能的影响

实验小鼠40只，雌雄各半，每组8只，分组及给药同1.1。末次给药后5 h，动物脱颈处死，取0.2 g肝脏制备10%的肝脏匀浆，用来测定其中SOD、T-AOC 和GSH-Px活性；同时留取部分肝脏用10%甲醛固定，观察其形态学变化。

1.7 实验方法

比色法测定血清和肝脏匀浆的SOD、NO、T-AOC、GSH-Px，ELISA法检测血清PGE2含量，具体方法按试剂盒说明进行。

1.8 数据分析

2 结果

2.1 花青素的镇痛作用

2.1.1 花青素对小鼠热板法痛阈的影响 各组小鼠在实验前基础痛阈没有统计学差异，给药7 d后，NS组痛阈没有出现统计学差异。与NS组相比较，Asp组在给药60 min后出现显著差异(P<0.01)，并一直持续至240 min；HA组在给药15 min和30 min明显提高痛阈(P<0.05)，给药60 min至240 min出现显著差异(P<0.01)；MA组在给药后30 min与NS组出现差异(P<0.05)，在给药60 min至240 min出现显著差异(P<0.01)；LA组在给药60 min和120 min两个时间点与NS组有差异(P<0.05)。与Asp组相比，HA组在给药15 min、30 min、240 min效果超过Asp组(P<0.05)，MA组与Asp组始终没有明显差异，LA组的效果在给药120 min、240 min时低于Asp组(P<0.05，表1)。

2.1.2 花青素对小鼠腹腔注射醋酸扭体反应的影响 Asp组与花青素各组均减少醋酸所致小鼠扭体反应次数(P<0.05)，HA组与NS组达到显著差异(P<0.01)，且效果超过Asp组(P<0.05)。MA组和LA组与NS组有统计学差异(P<0.05)，与Asp组没有差异(表2)。

Tab. 1 Influence of anthocyanins on the pain threshold of mice based on hot plate ±s，n=8)

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsAsp group

GroupDose(mg/kg)Timesoftwistbodyin15minInhibitionratio(%)NS38.67±5.61Asp10021.67±3.61*43.96HA9014.83±4.75**#61.65MA3022.83±2.64*#40.96LA1024.36±8.09*37.01

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsAsp group

2.1.3 花青素对小鼠镇痛血清SOD,NO及PGE2的影响 与NS组比较，Asp组和MA组提高小鼠血清SOD活性(P<0.05)，HA组效果达到显著差异(P<0.01)，且HA组效果超过Asp组(P<0.05)；LA组与NS组没有明显差异。与NS组比较，Asp组、MA组和LA组均降低小鼠血清NO含量和PGE2含量(P<0.05)，HA组达到显著差异(P<0.01)，且在降低NO含量的效果上超过Asp组(P<0.05，表3)。

GroupDose(mg/kg)SOD(U/ml)NO(μmol/L)PGE2(pg/ml)NS129.10±20.8238.64±3.25217.55±23.06Asp100150.43±23.08*29.56±6.32*168.24±18.62*HA90169.95±7.39**#24.22±2.56**#158.96±9.52**MA30155.24±19.62*30.54±4.32*172.55±12.55*LA10138.55±9.8132.22±5.21*185.96±15.22*

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsAsp group

2.2 花青素的抗炎作用

2.2.1 花青素对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 与NS组相比，HA组、MA组对醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高有抑制作用(P<0.05)，且HA组的抑制效果超过Asp组(P<0.05)。

GroupDose(mg/kg)ODvalueNS0.288±0.106Asp1000.238±0.091HA900.138±0.034*#MA300.184±0.015*LA100.286±0.047

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05vsNS group;#P<0.05vsAsp group

2.2.2 花青素对小鼠棉球肉芽肿增生的影响 与NS组相比，Asp组和HA组对小鼠棉球肉芽肿的抑制效果达到统计学意义(P<0.05)，而MA组和LA组结果与NS组没有统计学差异。

GroupDose(mg/kg)Dryweightofgranuloma(mg)Inhibitionratio(%)NS19.17±2.85Asp10014.03±4.12*26.81%HA9014.87±3.27*22.43%MA3017.38±4.089.34%LA1018.16±5.835.27%

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05vsNS group

2.2.3 花青素对二甲苯至小鼠耳廓肿胀程度的影响 与NS组相比，Asp和花青素各组均能抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀(P<0.05)，且HA组和Asp组的抑制作用达显著效果(P<0.01)。

GroupDose(mg/kg)Swellingdegree(mg)Inhibitionratio(%)NS4.78±2.24Asp1002.55±1.87**46.65%HA902.62±1.21**45.19%MA303.54±1.17*25.94%LA103.41±1.24*28.66%

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group

2.2.4 花青素对小鼠抗炎实验血清SOD、T-AOC活性及PGE2含量的影响 与NS组比较，Asp组和花青素各组均提高小鼠血清中SOD活性(P<0.05)，且各组效果没有差异；T-AOC活性也明显提高(P<0.05)，HA组的效果超过Asp组(P<0.05)。与NS组比较，Asp组、HA组和MA组的PGE2含量显著降低(P<0.01，P<0.05，表7)。

GroupDose(mg/kg)SOD(U/ml)T-AOC(U/ml)PGE2(pg/ml)NS158.79±32.654.85±0.88165.08±38.86Asp100190.65±21.47*6.07±1.16*118.91±17.77**HA90195.64±20.53*7.75±1.60*#112.85±21.38**MA30209.95±10.79*6.46±2.27*127.97±20.36*LA10204.68±18.27*6.14±2.36*144.68±22.69

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsAsp group

2.3 花青素对小鼠肝功能的影响

2.3.1 花青素对各组小鼠肝脏酶学变化的影响 与NS组比较，只有HA组小鼠肝脏匀浆的SOD和GSH-Px酶活力活性明显提高(P<0.05)；各浓度花青素组在提高T-AOC中都达到统计学意义(P<0.05)，且HA组达到显著差异(P<0.01)。

GroupDose(mg/kg)SOD(U/mgprot)T-AOC(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)NS48.76±10.950.478±0.117630.17±152.43Asp10058.35±4.290.632±0.246*650.86±52.38HA9069.95±9.15*0.703±0.085**710.21±116.40*MA3052.82±5.350.609±0.047*631.61±46.87LA1060.47±3.350.602±0.287*652.19±39.19

NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

*P<0.05，**P<0.01vsNS group

2.3.2 花青素对小鼠肝脏形态学变化的影响 与NS组一样，阿司匹林和花青素连续灌胃7天后，各组肝细胞轮廓清晰，核圆而大，着色深，居细胞中央，细胞质均匀，没有出现细胞破裂，胞质溶解，体积变小等毒副现象(图1)。

3 讨论

炎症是机体对损伤刺激所发生的防御反应，分为急性与慢性，急性炎症表现为红、肿、热、痛，毛细血管通透性增加等；慢性炎症持续时间长，表现为小血管及结缔组织增生等[10]。疼痛是机体受到伤害性刺激后所产生的一类保护性反应，常伴有恐惧、紧张不安等情绪活动，也是一种预警机制，以防止机体遭受进一步损伤，是临床上最常见的问题之一。疼痛与炎症常同时发生，最常用的镇痛药也是抗炎药如非甾体类抗炎药(如复方阿司匹林、吲哚美辛、布洛芬等)及阿片类药物(如哌替啶、吗啡、可待因等)，虽然这两类镇痛药都有较好疗效，但均有不同程度的不良反应，如非甾体类抗炎药有胃肠道反应，阿片类药物有不同程度的成瘾性，这使其在临床上的应用受到了很大的限制[11-13]。因此，寻找副作用和依赖性小的抗炎镇痛中药十分重要。

Fig. 1 Morphological changes of liver tissue in each group(HE ×400) NS： Normal saline； Asp： Aspirin； HA： High-concentration anthocyanin； MA： Medium-concentration anthocyanin； LA： Low-concentration anthocyanin

花青素的抗氧化、抗炎作用已得到证实[14-16]。本研究结果也显示，金叶女贞果实花青素能抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀；抑制醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性的增加；抑制棉球所致肉芽肿增生，表明金叶女贞果实花青素对急性炎症和慢性炎症均有一定的对抗效应。这种对抗作用可能与其增强小鼠的抗氧化作用(提高了SOD和T-AOC酶活性)和降低炎性因子PGE2的生成有关。本研究发现金叶女贞果实花青素能使小鼠热痛阈明显延长，醋酸致小鼠扭体次数也减少，提示花青素具有与阿司匹林类似的镇痛作用。镇痛机制可能与花青素提高小鼠抗氧化能力增强血清SOD活性，减少炎性因子NO和PGE2的生成有关。SOD是体内清除氧自由基的重要酶，能减少自由基对细胞的破坏，常用来反映体内自由基损害程度[17]。NO在炎症和痛觉中都起到重要作用：NO促进炎症反应的作用包括使血管舒张、形成水肿和局部红斑、增加炎性渗出等，NO作为中枢神经递质或第二信使可以直接或间接的激活瞬时感受器电位离子通道蛋白(Transient receptor potential ion channel protein, TRPs)，起到痛觉增敏效应[18-21]。本研究中花青素的抗炎与镇痛实验小鼠血清中PGE2含量都有所降低，PGE2是一类活性很强的炎症介质，在炎症组织中可与其它炎症介质起协调作用，加剧炎症反应，同时PGE2可以致痛，还有疼痛增敏作用，另PGE2的产生常伴有大量氧自由基的生成，继而引起细胞损伤[22,23]。肝脏是药物代谢、转化的主要脏器，又是机体代谢、免疫的主要器官。本研究中发现花青素连续给药7 d，肝脏组织结构未见明显变化，说明实验浓度的花青素对小鼠没有产生毒副作用；从生化指标结果看，花青素可以增强肝脏的抗氧化能力(提高SOD、T-AOC和GSH-Px酶活性)。

综上所述，本研究推测金叶女贞果实花青素通过增强小鼠的抗氧化能力及减少炎性因子的释放来发挥抗炎效应，进而达到镇痛作用，且在实验浓度范围内没有引起肝脏组织学变化。但是关于这种抗炎镇痛作用的最佳剂量、用药时间及具体的分子机制，以及对其他脏器是否有副作用有待于进一步研究。

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The mechanism of anthocyanin to anti-inflammatory and analgesic from Ligustrum fruit

WANG Jing1, WANG Jian-an2, JIANG Yu-xin1, ZHOU Ping-ping1, WANG Hai-hua1Δ

(1. Department of Physiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002； 2. College of Pharmacy, Jining Medical College, Rizhao 276826， China)

Objective: To provide a theoretical basis for the further development of new drugs, the analgesic and anti-inflammatory effects and the liver function in mice of anthocyanin from Ligustrum vicaryi were investigated. Methods: The 240 experimental mice were splitted equally for 6 kinds of experiments and 40 rats in each kind of experiment were divided into 5 groups (n=8)：normal saline control group (NS)；aspirin control group (Asp)；high-concentration anthocyanin group (HA)；medium-concentration anthocyanin group (MA)；low-concentration anthocyanin group (LA). The analgesia effect of anthocyanin at different concentration was determined by hot-plate test and acetic acid writhing test, and the anti-inflammatory effect of anthocyanin was performed by ear edema, abdomen capillary permeability and cotton granuloma. The activities of superoxide dismutase (SOD) and total antioxidant capacity(T-AOC) and the contents of nitric oxide (NO) and prostaglandin E2(PGE2) in blood serum were determined, and the activities of SOD, T-AOC and glutathione peroxidase (GSH-Px) in liver were measured, while the histological changes of liver tissue were observed. Results: The pain threshold of mice was enhanced and the times of twist body was decreased by medium-concentration and high-concentration anthocyanin. The activity of SOD was increased and the contents of NO and PGE2were reduced in blood serum. High-concentration anthocyanin inhibited the ear swelling , the increase of celiac capillary permeability and the granuloma hyperplasia, and increased the activities of SOD and T-AOC while decreased the content of PGE2. The activities of SOD, T-AOC, GSH-PX were increased in liver, but the morphology of liver tissues in each group had no significant changes. Conclusion: Anthocyanin of Ligustrum vicaryi has definite anti-inflammatory and analgesic effects, which is related to increasing the antioxidant capacity and decreasing the contents of NO and PGE2, and has not obvious damage to liver in the range of experimental concentration.

ligustrum vicaryi； anthocyanin; anti-inflammatory; analgesic; rats

国家自然科学基金(81172790)；安徽省自然科学研究重点基金(KJ2013A251)；皖南医学院中青年基金(WK201507)；安徽省质量工程项目(2013jyxm127)；日照市科技发展项目(2011SF006)

2015-01-26 【修回日期】2015-06-19

R965.2

A

1000-6834(2015)05-431-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.013

△【通讯作者】Tel: 0553-3932473; E-mail: wanghaihua9972@sina.com