内质网应激诱导的细胞凋亡在大鼠压疮深部组织损伤中的作用*

潘莹莹， 徐 洁， 王晓慧， 毛挺挺， 谢浩煌， 张宏宇， 肖 健， 李校， 姜丽萍△

(1. 温州医科大学护理学院, 2. 温州医科大学附属第一医院胸外科， 3. 温州医科大学药学院， 浙江 温州 325035)



内质网应激诱导的细胞凋亡在大鼠压疮深部组织损伤中的作用*

(1. 温州医科大学护理学院, 2. 温州医科大学附属第一医院胸外科， 3. 温州医科大学药学院， 浙江 温州 325035)

目的：观察压疮大鼠深部组织损伤(DTI)中肌细胞内质网应激(ERS)相关因子表达的变化，探讨内质网应激诱导的细胞凋亡在压疮深部组织损伤中的作用。方法：健康雄性SD大鼠50只，随机分为正常(Con)组，模型(Model)组，实验组(生理盐水(NS)组与4-苯基丁酸(PBA)组)，实验组按观察时间点又分为4 d，7 d，14 d，21 d四组(n=5)。PBA组于造模结束后2 ml生理盐水溶解PBA灌胃，隔天1次；NS组予等量生理盐水灌胃。于各时间点处死动物，收集受压肌肉组织。HE染色观察肌肉组织病理变化；TUENL染色观察细胞凋亡；免疫组化检测ERS分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP(CHOP)、凋亡酶12(Caspase 12)的水平。结果：HE染色显示与Con组相比，各实验组肌肉组织出现不同程度病理退化表现，PBA组与NS组相比，损伤程度有所缓解，新生肌纤维融合更快；TUNEL结果显示受压各组较正常组细胞凋亡数增加，于4 d达到高峰，以后逐渐下降，PBA干预后细胞凋亡有所减少(P<0.05)；免疫组化结果显示：肌肉组织NS组GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白表达在4 d达到高峰后逐渐下降。 NS组各蛋白在各时间点表达均明显高于PBA组(P<0.05)。结论：内质网应激诱导的细胞凋亡参与压疮深部组织损伤病理进程，其相关机制可能与CHOP、Caspase 12介导的的细胞凋亡有关。

内质网应激；细胞凋亡；压疮；深部组织损伤；4-苯基丁酸；大鼠

压疮是脊髓损伤患者、心血管疾病患者等长期

卧床或静坐患者常见的并发症，近年发病率居高不下。探索压疮的发病机制，可能为压疮新的治疗策略和治疗靶点提供理论依据，具有重要的临床意义。压疮的发生发展起源于深部组织损伤(deep tissue injury，DTI)，主要由肌肉组织逐渐向皮肤全层发展[1]，因此肌肉组织的病理变化在压疮深部组织损伤中更具研究意义。研究显示，肌肉组织细胞凋亡参与了压疮进展，可能是启动压疮发生和促使其不可逆发展的潜在关键因素[3]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是细胞应激状态下最初的反应之一，应激持续过强或过久时，可通过多种途径诱导细胞凋亡，引发组织损伤[2]。4-苯基丁酸(4-phenybutyric acid，4-PBA)是一种经典的内质网应激抑制剂，可明显降低内质网应激水平，抑制细胞过度凋亡，保护细胞功能[3]。压疮病变中肌肉组织发生ERS的具体分子作用机制及与组织损伤的关系，目前尚不清楚。因此，本研究通过建立大鼠压疮深部组织损伤模型，应用4-PBA观察ERS相关蛋白的表达变化，以期从正反两面探讨压疮深部组织损伤中ERS诱导细胞凋亡的分子机制。

1 材料和方法

1.1 动物与试剂

健康雄性SD大鼠(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SOXK(沪)2007-0005)，体重350～400 g，分笼喂养，自由饮食。4-PBA购自Sigma公司；TUNEL试剂盒购自碧云天公司；葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78 sc-1050),C/EBP homologous protein(CHOP, SC-575)购自santa cruz公司,Caspase 12 (ab-62464) 购自abcam公司。1.1.1 动物模型制备及方法 将50只雄性SD大鼠分为正常(Con)组，模型(Model)组，实验组(NS组与PBA组)，实验组按照不同观察时间又分为4 d、7 d、14 d、21 d四组(n=5)。采用谢浩煌等[4]的方法复制大鼠压疮深部组织损伤模型，在大鼠两侧后肢上下侧给予同样的永磁(直径0.8 mm，厚4 mm，2.4 g，磁通量3 500高斯)，经压力检测显示(5.0±2.0)mm厚度的条件下作用于大鼠受压组织的压强为40 kPa。施压12 h后放松12 h为一个循环，重复3个循环，施压时造成受压处血管压迫缺血，放松时血液灌流形成再灌注。模型(Model)组：3个循环结束后即可处死。 PBA组：受压3个循环后立即予4-苯基丁酸(1 g/kg，课题组前期摸索并结合文献报道得出该浓度)灌胃，隔天1次，4 d组为造模结束后第4 d处死，以此类推，观察至21 d。NS组：造模结束后给予等量生理盐水灌胃，其余操作同PBA组。

1.1.2 标本制备 实验终点，在冰上迅速切取各组受压中心肌肉组织(约500 mg)，于4℃冰生理盐水中快速洗去血液，用滤纸吸干水分并且剪碎后于-80℃超低温冰箱保存备用。另取相同部位受压肌肉组织(0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm), 4℃生理盐水洗净血液后，4%多聚甲醛-PBS液固定，脱水，常规石蜡包埋，蜡块连续切片5 μm厚，分别用于HE染色、免疫组化染色、TUNEL染色分析。

1.2 实验方法

1.2.1 HE染色 组织常规脱蜡，梯度透明，苏木精-伊红染色，用Nikon(TE2000-U)显微镜观察，NIS Elements图像采集软件采集图像，观察不同时间点受压肌肉组织病理学变化。

1.2.2 SABC免疫组化 甲醛固定和石蜡包埋肌肉组织样本切片、脱蜡、透明。采用SABC法,常规设立阴性对照(用抗体稀释液PBS代替一抗)。3% H2O2处理后热修复抗原，5% BSA封闭，CHOP 一抗浓度为 1∶100，GRP78 一抗浓度为 1∶100，Caspase 12 一抗浓度为 1∶1 000，于 4℃冰箱过夜。滴加二抗： 1% BSA 稀释二抗， 37℃恒温箱放置2 h。CHOP二抗浓度为1∶200，GRP78 二抗浓度为 1∶200，Caspase 12 二抗浓度为 1∶2 000，37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，镜下进行定性观察。阳性结果为棕黄色颗粒沉积，阴性对照显示胞核及胞膜呈蓝色，胞浆及整片组织呈淡蓝色背景。每张组织切片在×20物镜下观察5个视野(不重复)，并作图像采集，统计各张切片单位面积内(mm2)CHOP、GRP78、Caspase 12 阳性细胞数。

1.2.3 TUNEL染色 采用碧云天公司的TUNEL法凋亡检测试剂盒对受压肌肉组织细胞凋亡进行检测，检测过程按照试剂盒说明书进行。光镜下观察染色结果并拍照计数。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 HE染色观察受压肌肉组织形态学变化

光镜下观察发现：正常组大鼠肌纤维胞核大小均匀，排列紧密，结构清晰，无明显的炎性细胞浸润。Model组，肌纤维排列疏松，萎缩变性，间质成分多，大多细胞核萎缩消失，可见肌细胞明显坏死；4 d组骨骼肌结构已不可见，肌核内移，大量炎性细胞浸润；7 d组肌肉组织仍可见大量炎症细胞浸润，肌肉组织开始修复；14 d组仍有部分中性粒细胞，肌卫星细胞融合成一个较大的肌细胞；21 d组可见肌肉结构，肌细胞排列趋于整齐，肌间隙较为紧密。PBA组肌肉恢复较NS组更快，4 d炎症细胞浸润较NS组明显减少，7 d可见更多肌卫星细胞，14 d可见较为明显的骨骼肌结构，21 d基本恢复。(图1)

Fig. 1 Histological changes in compressed muscle tissue from different groups (HE×200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

2.2 各组大鼠肌肉组织中细胞凋亡情况

TUNEL染色的阳性细胞胞浆不着色，胞核被染成棕褐色，核固缩，染色质浓缩。光镜下观察发现Con组可见少数阳性颗粒，受压各组与正常组相比细胞凋亡数明显增加，NS组肌肉组织中凋亡细胞数于4 d表达最高，以后逐渐下降，14 d时检测几乎不表达。PBA干预后可见4 d时凋亡细胞大量减少(图2，表1，P<0.05)。

Fig. 2 Number of positive cells (TUNEL X 200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid

*P<0.05vsNS group

2.3 各组肌肉组织内质网应激相关蛋白表达变化

选取各时间点受压组织切片进行GRP78、CHOP、Caspase 12蛋白免疫组化法染色，棕褐色颗粒为阳性细胞。结果显示Con组和Model组有少量表达，NS组造模后4 d GRP78、CHOP、Caspase 12表达明显增加并达到高峰，以后逐渐下降。PBA组各时间点 GRP78、CHOP、Caspase 12表达相比较NS组有明显减少(图3，表2、表3、表4，P<0.05，P<0.01)。

Fig. 3 Immunohistochemistry for GRP78, CHOP and cleaved Caspase-12 in compressed muscle(×200) Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； GRP78： Glucose regulated protein 78; CHOP： C/EBP homologous protein

3 讨论

近年研究[5]证明缺血再灌注损伤是压疮发生的重要分子机制，其诱导的DTI可能是启动压疮病理变化的机制之一。缺血再灌注损伤引起细胞氧自由基产生、钙离子超载等病理环节，导致细胞凋亡，造成组织不可逆性损伤。内质网应激(ERS)相关的凋亡途径与缺血缺氧诱发细胞凋亡密切相关[6]。和其他组织不同，骨骼肌细胞富含丰富的内质网即肌浆网[7]，负责储存和释放钙离子，在老年性肌萎缩、多肌炎等病理生理过程中，骨骼肌有不同程度的ERS活化[8，9]。因此我们推测，ERS可能参与了压疮深部组织损伤的发生发展，其作用机制可能与其介导的骨骼肌细胞凋亡有关。本实验采用4-PBA干预压疮大鼠内质网应激水平，观察ERS相关细胞凋亡信号通路在压疮深部组织损伤中的表达变化，探讨细胞凋亡在压疮形成过程中的潜在作用，寻找早期干预的分子靶点。

本实验HE和 TUNEL结果表明受压后肌肉组织缺血、缺氧，导致细胞Ca2+超载、自由基产生增多，使受压肌肉组织出现逐步退化病理变化，出现肌纤维溶解断裂、玻璃样变，大量骨骼肌细胞凋亡。4 d后，随着缺血、缺氧、氧化应激等状态的改善，肌肉组织炎症逐渐消退，可观察到肌肉再生并逐渐融合。这与Fang Lin等[10]研究结果一致。PBA组大鼠肌肉组织的细胞凋亡明显减少，光镜下可见肌肉组织损伤减轻，表明长时间的应激引起错误折叠蛋白聚集，持续性的内质网应激参与了压疮中的组织损伤。

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； GRP78： Glucose regulated protein 78

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； CHOP： C/EBP homologous protein

**P<0.01vsNS group

Tab.

Con： Control； PBA： Phenybutyric acid； CHOP： C/EBP homologous protein

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

为了进一步探讨ERS诱导细胞凋亡的分子机制，本实验研究了ERS相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase 12的表达情况。GRP78作为内质网稳态的感受器，具有帮助未折叠蛋白正确折叠或促进错误折叠蛋白正确折叠的作用，是ERS保护性反应的重要标志[11]，同时也是下游通路激活的信号。本实验中，GRP78蛋白在受压后Model组高于Con组，表明骨骼肌受压后引起ERS稳态调节反应，启动生存性适应以恢复内质网的正常功能，此时对细胞凋亡的影响不大；随着观察时间延长，4 d组GRP78蛋白水平达到最高，以后呈递减趋势，提示随着骨骼肌细胞损伤加重，内质网腔内大量未折叠蛋白聚集稳态调节的能力逐渐下降，表明GRP78蛋白的稳态调节作用是有一定限度的。PBA给药后与NS各组相比，GRP78表达明显下降，表明PBA可从源头控制ERS水平。

研究证实，ERS启动的细胞反应开始是以恢复内质网稳态，维持细胞存活为目的[12]；但内质网应激过强时，促凋亡机制占主导，能够独立地诱导细胞凋亡，表现为CHOP、Caspase 12蛋白的高表达。CHOP是ERS促凋亡途径中的重要信号分子，CHOP蛋白在多条ERS介导的凋亡信号通路中充当共同的下游凋亡信号分子，因此，CHOP蛋白的表达在一定程度上反应了ERS介导的细胞凋亡水平[13]；Caspase 12是内质网应激特异性的凋亡因子，对ERS的凋亡反应最为敏感[14]，二者介导了两条ERS诱导的凋亡途径，在烧伤[7]、心肌炎[15]等疾病的发生发展起重要作用。本实验结果显示实验各组中的CHOP、Caspase 12的表达明显高于Con组，表明压疮深部组织损伤中存在ERS；二者水平于4 d时达到高峰，以后逐渐下降，同时伴有细胞凋亡数增多，表明缺血/再灌注损伤引起细胞的长期应激，导致氧化应激、钙离子超载，随着骨骼肌细胞进一步受损，胞质内丰富的内质网稳态打乱，内质网功能障碍，信号由促生存转为促凋亡，通过CHOP、Caspase 12途径诱导细胞凋亡，造成组织损伤。本实验内质网应激相关蛋白表达趋势与林可[16]，褚万立等[7]研究结果一致，提示CHOP和Caspase 12介导的内质网凋亡途径参与了压疮肌肉组织细胞凋亡的过程，并在一定程度上对骨骼肌细胞凋亡起到了促进作用，导致压疮的发生。本研究发现，应用4-PBA处理后，各时间点受压肌肉组织中ERS凋亡相关蛋白CHOP、Caspase 12的表达下降，细胞凋亡水平减轻，说明PBA可在一定程度上减轻ERS带来的组织损伤，也从反面证明ERS介导的细胞凋亡在压疮深部组织损伤病变进程中起重要作用。

综上所述，本实验验证了ERS关键信号因子GRP78、CHOP、Caspase 12参与了压疮深部组织损伤的发生发展。4-PBA能在一定程度上通过抑制 ERS相关蛋白的表达，减轻细胞凋亡，从而对受压组织起到保护作用。调控受压肌肉组织的ERS水平，可能是改善压疮病理变化的重要靶点，为今后的研究提供了理论依据。

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The role of cell apoptosis mediated by endoplasmic reticulum stress (ERS) of deep tissue injury of pressure ulcer of rats

PAN Ying-ying1, XU Jie2, WANG Xiao-hui1, MAO Ting-ting1, XIE Hao-huang1, ZHANG Hong-yu3, XIAO Jian3, LI Xiao-kun3, JIANG Li-ping1△

(1. Collage of Nursing, 2. Department of Cerebral Surgey, the First Affilicated Hospital, 3. College of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

Objective: To observe the the expression of endoplasmic reticulum stress (ERS) related factors in deep tissue injury (DTI) at pressure ulcer rat and to investigate the ERS mechanism of DTI in muscle tissue and protective effect of 4- phenylbutyric acid (4-PBA) in local tissue. Methods: Fifty male SD rats were randomly devided into control group, model group, experimental group NS group and PBA group, the experimental groups were divided into 4 d, 7 d, 14 d and 21 d group according to the observation time (n=5). Rats in the PBA group were administrated with gastric perfusion of 4-PBA after the modeling; the NS group was given normal saline of the same quantity.Using HE staining to observe morphologic character. The expression of glucose regulated protein 78( GRP78), CHOP, Caspase 12 were detected by immunohistochemical staining. Cell apoptosis was detected by TUNEL assay. Results: HE staining results showed that each group demonstrated compression injury compared with control group: cellular swelling, ompaction of nuclear, and apoptosis in muscle tissue. The new muscle fiber in 4-PBA group fused faster than those in NS group. The number of TUNEL positive cells peaked at 4 day after compression, then got decreased on day 7 in muscle tissue, apoptosis positive cells were diminished after 4-PBA treatment. The immunohistochemical staining results showed that the expression of protein GRP78, CHOP, Caspase 12 peakd 4 d after modeling and decreased gradually. The GRP78, CHOP, Caspase 12 protein expression were significantly higher than those of PBA group at all time points (P<0.05). Conclusion: Cell apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress took part in deep tissue injury resulting of pressure ulcer, which mechanism might be related to reducing apoptosis mediated by CHOP, Caspase 12.

endoplasmic reticulum stress; apoptosis; pressure ulcer; deep tissue injury; 4-PBA

国家自然科学基金资助项目(81372064)

2014-12-29 【修回日期】2015-03-04

R632.1

A

1000-6834(2015)05-396-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.004

△【通讯作者】Tel： 0577-86689836； E-mail： jlp@wmu.edu.cn