高糖对大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响及其机制*

张 静， 楚海荣， 郭 英， 刘建华， 李文凭， 李 宏， 成 敏△

(1. 潍坊医学院临床学院， 2. 潍坊医学院医学研究实验中心， 山东潍坊 261053)



高糖对大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响及其机制*

张 静1， 楚海荣2+， 郭 英1， 刘建华2， 李文凭1， 李 宏2， 成 敏2△

(1. 潍坊医学院临床学院， 2. 潍坊医学院医学研究实验中心， 山东潍坊 261053)

目的：探讨高糖对大鼠血管平滑肌细胞( VSMCs)表型转化的影响及机制。方法：大鼠VSMCs由组织贴壁法培养获得，以3～5代细胞为靶细胞，待细胞融合后用含有2%胎牛血清的DMEM孵育12 h，再置于正常组(5.5 mmol/L glucose)、高糖(25 mmol/L glucose)、高糖+P38抑制剂SB203580的DMEM继续培养24 h。用实时荧光定量RT-PCR分析各组VSMCs合成型标志蛋白OPN、收缩型标志蛋白α-SMA及基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的基因表达情况；Western blot检测各组OPN、α-SMA和磷酸化P38的蛋白表达情况。结果：①高糖促进了VSMCs的表型由收缩型转化为合成型，同时上调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达；②高糖能促进P38蛋白的磷酸化,增加磷酸化P38的蛋白表达量；③P38/MAPK信号通路抑制剂SB203580明显抑制了高糖促进VSMCs表型转化及MMP-2、MMP-9表达的效应。结论：高糖能通过P38/MAPK信号通路促进VSMCs的表型转化。

大鼠，平滑肌细胞，高糖，表型转化，P38/MAPK信号通路

糖尿病心脑血管并发症是影响人体生命健康的主要原因。研究显示，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)具有收缩型和合成型两种表型，其表型由收缩型向合成型转化是一系列心脑血管并发症(血管狭窄后重构和动脉粥样硬化)发生发展的关键性起始步骤，且合成型的平滑肌细胞能促进细胞的增殖和迁移、调节细胞外基质的分泌[1]。研究已证实，高糖作为糖尿病心血管并发症

的独立危险因素，可以促进平滑肌细胞的增殖和迁移[2，3]，但目前有关高糖对平滑肌细胞表型转化的影响及报道甚少。本研究旨在探讨高糖对血管平滑肌细胞表型转化的影响其可能机制，为临床糖尿病心血管并发症的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖型和正常型培养基(HyClone公司，美国)；胰蛋白酶(HyClone公司，美国)；胎牛血清(HyClone公司，美国)；OPN抗体、α-SMA抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；磷酸化的P38单克隆抗体(cell signaling公司)；HRP-山羊抗兔抗体(北京中杉金桥生物有限公司)；小鼠抗β-actin抗体(北京中杉金桥生物有限公司)；HRP-山羊抗小鼠抗体(碧云天生物技术研究所)；BCA蛋白浓度试剂盒(Thermo scientific公司)；5% CO2培养箱(Thermo，美国)；TRIzol(Invitrogen公司)；荧光定量PCR仪( Bio-RadIQ5)，SYBR PrimeScriptaRT-PCR Kit II 及相关引物设计合成( 大连宝生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胸主动脉VSMCs的分离、培养和鉴定 按照本室以往的方法[4]：将颈椎脱臼处死的大鼠于75%的酒精中浸泡15 min。纵向剪开无菌分离的大鼠胸主动脉管腔并去除内膜。移入超净台内盛有20%DMEM的无菌器皿中剪成2 mm×5 mm小块，用吸管移入含4 ml培养液的25 ml细胞培养瓶中，让细胞分散粘贴在培养瓶壁上，倒放。在5%CO2、37℃的培养箱中静置培养4～6 h后轻轻翻转培养瓶，让培养液缓慢没过组织块，继续静置培养。待细胞生长到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶1∶1传代。在倒置显微镜下观察培养的细胞并拍照，用特异性α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth-actin,α-SMA)进行免疫荧光染色。

1.2.2 实验分组 将处于对数生长期3～5代的平滑肌细胞按4×105cells/ml的密度接种于6孔板中，待细胞密度达90%时，用含2%胎牛血清的正常DMEM同步化12 h后，分组如下:(1)正常组(5.5 mmol/L glucose)；(2)高糖组(25 mmol/L glucose)；(3)高糖+P38抑制剂SB203580组。

1.2.3 荧光定量RT-PCR检测OPN、α-SMA和基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9基因的表达 按TRIzol试剂说明书提取总RNA，溶于DEPC水中，-80℃保存备用。SYBRGreen荧光定量RT-PCR检测各组OPN、α-SMA、MMP-2和MMP-9的基因表达量。相关基因引物由大连宝生物设计合成，其序列如表1所示。实验中阴性对照为超纯水(无RNA酶，PCR级)，内参为管家基因GAPDH。按2-ΔΔCt计算各组的扩增效率。

Tab. 1 Oligonucleotide primers used for reverse transcription-polymerase chain reaction

GenesSequencesofprimersOPNForwardprime:5'-GCATCCTTGGCTTTG-CAGTC-3'Reverseprime:5'-TGGCTACAGCATCTGAGT-GTTTG-3'α-SMAForwardprime:5'-AGCCAGTCGCCATCAG-GAAC-3'Reverseime:5'-CCGGAGCCATTGTCACACAC-3'MMP-2Forwardprime:5'-TCCCGAGATCTGCAAG-CAAG-3'Reverseprime:5'-AGAATGTGGCCACCAG-CAAG-3'MMP-9Forwardprime:5'-AGCCGGGAACGTATCTG-GA-3'Reverseprime:5'-TGGAAACTCACACGC-CAGAAG-3'GAPDHForwardprime:5'-GGCACAGTCAAGGCT-GAGAATG-3'Reverserime:5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAG-TA-3'

1.2.4 Western blot检测磷酸化P38、OPN和α-SMA的蛋白表达 按照蛋白提取试剂说明书提取细胞蛋白,在4℃ 12 000 r/min条件下离心5 min,抽取上清，放置于-80℃冰箱保存备用。将蛋白上清与SDS-PAGE上样缓冲液按比例充分混匀，100℃恒温水浴锅中加热5 min后于-20℃冰箱保存。于12%聚丙烯酰胺凝胶中上样(50 μg/well)进行还原性SDS PAGE电泳约3.5 h，转膜(PVDF膜)用湿转法，200 mA恒流50 min。用5%的BSA封闭1 h,在4℃孵育一抗(P-P38 1∶1 000,OPN 1∶300, α-SMA 1∶400)过夜，用TBST震荡洗涤5×10 min/count，在室温条件下孵育二抗山羊抗兔抗体(1∶5 000)1 h, 用TBST震荡洗涤5×10 min，用ECL发光试剂在暗室中显色，结果用图像分析软件Gel-Pro analyzer对目的条带进行扫描和密度分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 VSMCs的分离、培养和鉴定

原代细胞培养4～7 d, 有细胞以组织块为中心呈放射状萌出。细胞向外生长形成细胞晕，进而形成细胞簇。胞体呈长梭形、三角形或不规则形，有多个突起，长短不一，胞核呈卵圆形居中，有多个核仁。原代细胞体积小，折光性强；传代后的细胞体积增大，折光性减弱，呈典型的“峰-谷”状生长。α-SMA免疫荧光染色阳性。

2.2 高糖对VSMCs表型转化的影响

在高糖状态下，VSMCs合成型标志蛋白OPN的基因表达量明显升高，为正常组的(2.84±0.19)倍；而收缩型标志蛋白α-SMA的基因表达量下降，为正常组的(0.62±0.09)倍，表明高糖促进了VSMCs由收缩型向合成型转化(图1)。

2.3 高糖对平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9基因表达的影响

基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9在高糖组的基因表达量分别为(0.244±3.118)、(0.442±2.221)较正常组 (0.163±0.899)、 (0.171±0.912)明显升高(P<0.01)。SB203580组的基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的基因表达量分别为(0.148±0.423)、(0.147±0.628)均较高糖组(0.442±2.221)、(0.244±3.118)明显降低(P<0.01，图2)。

2.4 高糖对VSMCs磷酸化P38蛋白表达的影响

与正常组相比，正常组磷酸化P38的蛋白表达量较少(0.103±0.003)，高糖处理明显增加了磷酸化P38的蛋白表达量(0.477±0.013 )(P<0.01,图3)。

2.5 P38/MAPK信号通路抑制剂SB203580对VSMCs表型转化的影响

基因结果显示：P38/MAPK信号通路抑制剂SB203580抑制了高糖对VSMCs表型转化的影响，蛋白结果进一步证实：合成型标志蛋白OPN的表达量下降而收缩型标志蛋白α-SMA的表达量升高(P<0.05，图4)。

3 讨论

在糖尿病患者中，心血管并发症是危害人体健康的主要疾病。长期的高血糖除了引起内皮损伤、血小板黏附、导致血栓形成外，同时炎性细胞向受损内皮处聚集并释放大量炎性因子，刺激内膜平滑肌细胞增殖，促进动脉粥样硬化的发生[5]。VSMCs是组成血管壁的主要细胞，具有收缩型(分化型)和合成型(去分化型)两种表型。在健康血管中，VSMCs位于血管壁的中膜，处于分化状态。当血管内皮细胞受损或受其他因素刺激时，处于分化状态的VSMCs会返回去分化状态，并获得增殖和迁移等能力。VSMCs的表型转化在心血管疾病如动脉粥样硬化、高血压、哮喘和血管动脉瘤中发挥着至关重要的作用。揭伟等的研究表明，高糖能上调大鼠主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白表达[6]。在本实验中，高糖能促进VSMCs表型由收缩型转变为合成型，即收缩型标志分子α-SMA的基因和蛋白表达降低，而合成型标志分子OPN的基因和蛋白表达增加。与此同时，合成型的VSMCs表达基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的水平也明显增高。此外，基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达能促进VSMCs由血管壁的中膜向内膜下迁移，促进血管形成新生内膜，从而加速了动脉粥样硬化的形成[7]。

研究显示，多条信号通路参与了VSMCs表型转化的调节，其中蛋白质的磷酸化是其改变基因表达的直接方式[8]。P38/MAPK是参与细胞内炎症反应的重要信号通路,可被多种细胞外刺激激活由非磷酸化状态转变为磷酸化状态, 通过促进下游底物的磷酸化实现对细胞生长、增殖、分化和某些因子表达的调控[9，10]。李艳波等的研究表明，高糖可激活P38/MAPK信号通路，促使细胞产生单核细胞趋化因子MCP-1、环氧化酶COX-2、G蛋白偶联趋化因子受体CXCR3等，进而促进动脉粥样硬化的形成[11，12]。在本实验中，高糖促进了VSMCs由收缩型转化为合成型，同时高糖组磷酸化的P38蛋白表达量明显增加。然而，当用SB203580特异性的抑制P38/MAPK信号通路后，VSMCs的表型转化受到抑制，同时其分泌的MMP-2和MMP-9也明显减少，说明P38/MAPK信号通路介导了高糖诱导的平滑肌细胞的表型转化。

总之，高糖可通过P38/MAPK信号通路促进VSMCs发生表型转化，增加MMP-2和MMP-9的分泌，增强其对基底膜的降解能力，促进动脉粥样硬化的形成。本结果完善了糖尿病患者高发心血管疾病的机制，为临床糖尿病心血管并发症的防治提供了理论依据。

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The effects and mechanisms of high glucose on the phenotype transformation of rat vascular smooth muscle cells

ZHANG Jing1, CHU Hai-rong2+, GUO Ying1, LIU Jian-hua2, LI Wen-ping1, LI Hong2, CHENG Min2△

(1. Clicinal College, Weifang Medical University, 2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang 261053, China)

Objective: To investigate the effects and mechanisms of high glucose on the phenotype transformation of rat vascular smooth muscle cells (VSMCs). Methods: VSMCs were isolated from rat thoracic aorta and the 3rd～5thVSMCs were incubated with normal glucose (5.5 mmol/L), high glucose (25 mmol/L), or high glucose (25 mmol/L) +P38 inhibitor(25 mmol/L+SB203580) for another 24 hours.Then the gene expression of osteopontin(OPN), alpha smooth-actin(α-SMA),matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and matrix metalloproteinase-9(MMP-9) were assayed by real time RT-PCR, the protein expression of P38 were assayed by Western blot. Results: ①High glucose promoted the phenotype transformation of VSMCs and up-regulated the expression of MMP-2 and MMP-9. ②High glucose promoted the phosphorylation of P38. ③SB203580, the inhibitor of P38/MAPK signal pathway, inhibited the effects of high glucose on phenotype transformation and expression of MMP-2 and MMP-9. Conclusion: High glucose may promote phenotype transformation of VSMCs via the signal pathway of P38/MAPK.

rat; vascular smooth muscle cells; high glucose; phenotype transformation; P38/MAPK

国家自然科学基金资助项目(30900290，31270993)；国家教育部“新世纪优秀人才计划”资助项目(NCET10-0922)；山东省自然科学基金(ZR2013CQ032)；山东省高等学校科技计划项目(J11LF17)；山东省中医药科技发展计划项目(2013-239)

2015-01-26 【修回日期】2015-06-09

R331.3

A

1000-6834(2015)05-458-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.019

△【通讯作者】Tel： 0536-8462463； E-mail： chengmin1976@wfmc.edu.cn；+： 共同第一作者