氧化炎症级联反应在二氯二丁基酯联合乙醇诱发的小鼠胰腺纤维化进展中的作用*

刘 芳， 史迎莉， 张晓芹， 许小凡， 陈 瑜， 张 红△

(1. 陕西中医药大学 基础医学院， 2. 医学科研实验中心， 西安 712046)



氧化炎症级联反应在二氯二丁基酯联合乙醇诱发的小鼠胰腺纤维化进展中的作用*

刘 芳1， 史迎莉2， 张晓芹1， 许小凡2， 陈 瑜1， 张 红2△

(1. 陕西中医药大学 基础医学院， 2. 医学科研实验中心， 西安 712046)

目的：探讨胰腺氧化炎症级联反应在二氯二丁基酯(DBTC)联合乙醇诱发小鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化进展中的作用及机制。方法：健康昆明小鼠36只，随机分为两组(n=18)：对照组和模型组，模型组经尾静脉一次性注射DBTC(8 mg/kg)后加饮10%乙醇饲喂诱发慢性胰腺炎。造模后2、4、8周处死动物， HE及Masson胶原纤维染色观察胰腺组织的病理学改变及纤维化程度，免疫组织化学法检测F4/80的表达；制备胰腺组织匀浆检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)的变化。结果：模型组小鼠HE染色和Masson染色显示造模2周后可见成纤维细胞出现、巨噬细胞(F4/80阳染)浸润，4周及8周巨噬细胞浸润增加、伴随胰腺实质明显减少并被大量纤维组织取代。胰腺组织匀浆SOD活性逐渐降低，MDA和MPO逐渐升高，与对照组同时间点相比，有显著性差异(P<0.05)。结论：DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇可以成功建立小鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化模型，氧化炎症级联反应在胰腺纤维化进展中发挥重要的作用。

胰腺纤维化；氧化炎症级联反应；F4/80；SOD；MDA；MPO；小鼠

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是胰腺实质结构局限性或弥漫性的慢性炎症，胰腺腺泡和胰岛细胞会出现不可逆性损害、萎缩或消失,引起不同程度胰腺内、外分泌功能障碍，伴有难治性疼痛症状的疾病[1]。随着生活水平的提高和检查、诊断水平

的提升，发病率有明显升高趋势[2]。虽然CP的病因多样，发病起始机制各异，但最终的病理结局大多是以胰腺纤维化为主要病理学特征[3]。慢性胰腺炎的病因复杂，在我国以胆源性疾病导致的胆管狭窄、梗阻为主要病因，二氯二丁基酯(dibutyltin dichloride ,DBTC)是脂溶性物质，经尾静脉注射至动物体内，经肝脏、胆囊排泄至胰管，引起胰管上皮细胞损伤坏死，坏死的上皮细胞脱落聚集，阻塞胰胆管，造成类似临床上的胰、胆管阻塞[4]，可成功复制胰腺炎模型。而慢性酒精中毒是西方国家慢性胰腺炎的主要病因，近年来因酒精引发的慢性胰腺炎在我国也呈现增多趋势[5]。氧化炎症级联反应(oxidative inflammatory cascade,OIC)，是指由炎症和氧化应激反应相互作用而引起的、通过正反馈调节的一系列事件，近年来成为研究炎症反应的热点。本课题采用尾静脉一次性注射DBTC联合10%乙醇饮用复制小鼠慢性胰腺炎模型，观察胰腺组织形态学、F4/80表达、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的变化，探讨氧化炎症级联反应在DBTC联合乙醇诱发的小鼠胰腺纤维化模型中的作用。

1 材料与方法

1.1 药品试剂和仪器

DBTC购于Sigma-Aldrich；大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体(sc-71088)购于Santa Cruz；即用型SABC免疫组化试剂盒(博士德试剂公司)；SOD、MDA和MPO试剂盒(南京建成生物研究所)；分光光度仪(DU530，Beckman)；显微镜及图像采集系统(Zeiss A1)。

1.2 动物分组及造模

将健康昆明小鼠36只，购自第四军医大学动物实验中心，动物合格证书号0001249 ( 6～8周龄，体重20～28 g)实验前置清洁级环境适应性饲养1周，常规饲料，常规饮水，保持室温在20℃～25℃，12 h昼夜交替，7 d后用于实验研究。

DBTC 160 mg溶于40 ml无水乙醇，再缓慢加入生理盐水至50 ml,摇至清亮(3.2 mg/ml)，经尾静脉一次性注射DBTC(8 mg/kg)后加饮10%乙醇(90 ml水+10 ml无水乙醇)替代正常饮水饲喂造模。

小鼠随机分为对照组和模型组 (n=18)：对照组尾静脉注射0.9%氯化钠溶液(25 μl/10 g体重)，正常饮水；模型组尾静脉注射DBTC，饮10%乙醇。造模后各组再在2周、4周和8周(n=6)3个时间点进行后继实验。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 分别在造模后2周、4周、8周麻醉处死动物，完整摘除胰腺称重，将部分胰腺用10%中性福尔马林溶液固定，用于病理学观察；部分胰腺新鲜组织液氮保存用于制作组织匀浆行SOD、MDA和MPO检测。

1.3.2 胰腺组织的病理学观察 胰腺组织经脱水、包埋、切片，HE染色观察各组小鼠胰腺组织的形态学改变；胶原纤维染色(Masson)石蜡切片，常规脱蜡至水，苏木素浸染5 min， 1%盐酸分化，Masson复合染色液(丽春红0.7 g、酸性品红0.3 g、冰醋酸1 ml、蒸馏水99 ml)浸染5 min， 1%的磷钼酸液处理5 min，2%苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸水处理1 min，脱水，封片，观察胰腺组织纤维化程度。

1.3.3 免疫组织化学法检测胰腺F4/80表达 取相应时间点小鼠胰腺石蜡切片，脱蜡至水，3%H2O2室温孵育5～10 min,羊血清封闭液室温封闭30 min。滴加1∶300 稀释的 F4/80 抗体， 4℃湿盒过夜,PBS清洗后滴加1∶500生物素化二抗孵育40 min，PBS清洗后DAB显色，苏木精复染，封片显微镜下观察、拍照。

1.3.4 酶化学法检测胰腺组织匀浆SOD、MDA和MPO的水平 将胰腺组织匀浆，按试剂盒说明书操作, 测定吸光度(A)值。根据公式计算标本每毫克组织蛋白中SOD、 MDA和MPO 含量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 胰腺组织病理学变化和纤维化程度

HE染色结果表明：模型组造模2周胰腺组织水肿，炎症细胞浸润，成纤维细胞出现；4周纤维化程度明显，腺泡和胰腺萎缩，原有小叶结构被增生的纤维组织分割，大量炎症细胞浸；8周胰腺实质组织结构破坏明显，纤维化程度加深，呈典型的慢性胰腺炎病理表现。Masson染色，2周蓝染的胶原纤维在胰腺间质中少量出现；4周和8周胰腺实质腺泡明显萎缩，大量蓝染的胶原纤维在间质中广泛增生呈网格状分隔胰岛和腺泡细胞，呈现典型的慢性纤维化改变(图1)。

Fig. 1 Pathological changes and the degree of fibrosis in the pancreas induced by DBTC plus ethanol (×200) DBTC: Dibutyltin dichloride

2.2 胰腺组织F4/80的表达变化

免疫组化法检测发现：造模2周胰腺组织F4/80阳染的巨噬细胞数量较对照组明显增加，随着造模时间的延长，F4/80的表达进一步增加，巨噬细胞浸润更为显著,并伴随明显的胰腺纤维化(图2)。

Fig. 2 Macrophages infiltration in model group (×400)

2.3 胰腺组织匀浆SOD、MDA和MPO活性变化

DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇后，随造模时间延长胰腺组织中SOD活性持续降低，组间差异有显著性(P<0.05,)；MDA持续升高，与对照组相应时间点对比，有显著性差异(P<0.05,)，且组间差异有显著性(P<0.05,)。在造模2周、4周时，胰腺组织中MPO升高，与同时间点对照常组对比有明显差异(P<0.05)；8周时MPO略有增高，与正常组相比无统计学差异，造模后各组之间差异有显著性(P<0.05，表1)。

GroupSOD(U/mg·pro)MDA(nmol/mg·pro)MPO(U/)g·proControl2w389.89±7.915.90±0.140.70±0.134w387.63±3.556.29±0.980.73±0.128w389.27±6.055.19±0.620.65±0.14Model2w295.74±6.97*7.04±0.19*1.09±0.15*4w250.26±7.42*#9.22±0.31*#1.09±0.141*#8w184.87±9.20*△15.14±1.30*△0.72±0.14△

SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde; MPO： Myeloperoxidase

*P<0.05vscontrol at the same time；#P<0.05vsmodel 2 w group;△P<0.05vsmodel 4 w group

3 讨论

慢性胰腺炎是由于胆道疾患或长期饮酒引起的胰腺实质局限性或弥漫性的慢性炎症，腺泡和胰岛细胞会出现不可逆性损害、萎缩或消失,引起不同程度的胰腺内、外分泌功能障碍[6]。采用尾静脉注射DBTC复制慢性胰腺炎模型的同时在饮水中加入乙醇，发现乙醇可以加剧胰腺损伤的强度和进程。此方法诱发大鼠慢性胰腺炎模型已经被多个实验所证实[7,8]。但是由于小鼠的胆道解剖结构与大鼠有所不同[9]，相同方法是否也会诱发小鼠慢性胰腺炎及其机制目前尚不清楚。

本文采用DBTC尾静脉注射联合长期饮用乙醇的方法复制小鼠慢性胰腺炎，是参照Vera Portocarrero等[10]在注射DBTC基础上加10%的乙醇饲喂，加剧胰腺损伤的进程和强度，产生较符合人类CP病理形态学特征及其血清学改变的CP模型， 通过这种单次注射，成功率可达80%，并且成本较低的造模方法来复制的CP模型，适合药物治疗研究。本实验结果验证此方法可以成功复制小鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化模型。

近来有学者提出了氧化炎症级联反应(oxidative inflammatory cascade，OIC)的概念，是指由炎症和氧化应激反应相互作用而引起的、通过正反馈调节的一系列事件[11]。氧自由基是炎症反应的效应器，氧自由基的过度产生能诱导炎症反应加重[12]。处于慢性氧化应激状态的机体，可以促使巨噬细胞活化，使炎症复合物水平升高超过抗炎复合物的控制，引起机体促炎和抗炎网络失衡和系统性的低度慢性亚临床促炎状态[13]。同时研究发现，氧化应激反应可以促进细胞因子及黏附分子的释放，增强炎症细胞的黏附能力，导致炎症细胞在反应局部浸润、聚集、活化，引发局部炎性损伤。局部浸润的炎症细胞不仅可以促进细胞因子的释放，而且促进局部的脂质过氧化反应。由此可见: 氧化应激与炎症反应二者可以相互作用使慢性炎症得以持续，炎症损伤不断增强[14]。

越来越多的研究结果表明,氧化应激在胰腺慢性炎症和纤维化中起重要作用。氧化应激反应不仅是慢性胰腺炎病因之一，也伴随疾病发展演变的过程[15]。SOD是一种生物活性蛋白质，能有效地清除氧自由基，同时也是唯一的以自由基为底物的酶，在维护生物机体内自由基产生与清除的动态平衡中起着重要的作用[16]。过多的氧自由基如果不能得到及时清除，将在组织中堆积，与细胞膜上不饱和脂肪酸发生反应，生成脂质过氧化的产物MDA等引起炎症反应、组织损伤等改变。F4/80是成熟巨噬细胞表达的一种蛋白，是巨噬细胞活化的标志。MPO是由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一，它可以催化底物过氧化氢和氯离子生成产物次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基，参与炎症反应的氧化应激过程[17]。胰腺巨噬细胞浸润增加的同时，胰腺组织匀浆MPO的活性也明显升高，提示慢性胰腺炎纤维化进展伴随着巨噬细胞在胰腺浸润聚集，从而导致髓过氧化物酶活性升高,氧化能力增强，产生过多的氧自由基。而此时由于胰腺的SOD活性降低，不能有效清除组织中的自由基，导致自由基在胰腺组织中堆积，与细胞膜上不饱和脂肪酸发生反应，则生成大量MDA，进一步引起炎症反应、组织损伤。

本研究结果表明，DBTC尾静脉注射联合饮用乙醇是一种复制小鼠慢性胰腺炎的可靠方法，氧化应激介导的自由基增加和炎症细胞反应在慢性胰腺炎胰腺纤维化中发挥了重要的作用，氧化炎症级联反应在DBTC联合乙醇诱发的小鼠胰腺纤维化进展中发挥重要的作用，可以作为遏制慢性胰腺炎胰腺纤维化的靶点。

[1] 叶任高, 陆再英. 内科学(5版)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2000: 493.

[2] 狄 扬, 傅德良. 慢性胰腺炎胰腺纤维化发病机制的研究进展[J]. 中国实用外科杂志, 2011, 31(9): 826-829.

[3] Treiber M, Neuhøfer P, Anetsberger E,etal. Myeloid, but not pancreatic, RelA/p65 is required for fibrosis in a mouse model of chronic pancreatitis[J].Gastroenterol, 2011, 141(4): 1473-1485.

[4] 何新红, 陆建平, 廖 专, 等. 二丁基二氯化物尾静脉注射建立大鼠慢性胰腺炎模型[J]. 胰腺病学, 2007, 7(1): 17-20.

[5] 叶 博, 胡良白皋, 廖 专, 等. 2180例慢性胰腺炎临床特征及治疗模式变迁分析[J]. 中华消化内镜杂志, 2013, 30(1): 10-14.

[6] 王洛伟, 李兆申, 李淑德, 等. 慢性胰腺炎全国多中心流行病学调查[J]. 胰腺病学, 2007, 7(1): 1-5.

[7] Merkord J, Weber H, Jonas L,etal. The influence of ethanol on long-term effects of dibutyltin dichloride (DBTC) in pancreas and liver of rats[J].HumExpToxicol, 1998, 17(3): 144-150.

[8] Sparmann G, Merkord J, Jaschke A,etal. Pancreatic fibrosis in experimental pancreatitis induced by dibutyltin dichloride[J].Gastroenterol, 1997, 112(5): 1664-1672.

[9] 田小芸, 孙敬方. 啮齿类动物胰管开口的比较及胰液采集方法[J]. 中国实验动物学报, 2000, 8(4): 255-258.

[10]Vera-Portocarrero LP， Lu Y， Westlund KN. Nociception in persistent pancreatitis in rats： effects of morphine and neuropeptide alterations[J].Anesthesiol, 2003, 98(2): 474-475.

[11]阿力木江·阿布力米提. 从氧化炎症级联反应角度探讨雌激素对心血管的保护作用[J]. 中国循证心血管医学杂志, 2010, 02(4): 243-245.

[12]Gill R, Tsung A, Billiar T. Linking oxidative stress to inflammation: Toll-like receptors[J].FreeRadicBiolMed， 2010, 48(9): 1121-1132.

[13]Franceschi C, Capri M, Monti D,etal． Inflammaging and anti-inflammaging: a systemic perspective on aging and longevity emerged from studies in humans[J].MechAgeingDev, 2007, 128(1): 92-105.

[14]Bhardwaj P, Yadav RK. Chronic pancreatitis: role of oxidative stress and antioxidants[J].FreeRadicRes, 2013, 47(11): 941-949.

[15]Zeki S, Miura S, Suzuki H,etal． Xanthine oxidasederived oxygen radicals play significant roles in the development of chronic pancreatitis in WBN /Kob rats[J].JJastroenterolHepatol, 2002, 17(5): 606-616.

[16]张英锋, 裴中会, 阮栋梁． SOD—一种超氧化物歧化酶[J]. 化学世界, 2004, 45(2): 112.

[17]Heinecke JW.Pathwaysforoxidation of lowdensity lipoprotein by myelperoxidase: Tyrosyl radical, reactive aldehydes, hypochlorous acid andmolecular chlorine[J].Biofactor, 1997, 6(2): 145-155.

The role of oxidative inflammatory cascade on pancreatic fibrosis progression in mice induced by DBTC plus ethanol

LIU Fang1, SHI Ying-li2, ZHANG Xiao-qin1, XU Xiao-fan2, CHEN Yu1, ZHANG Hong2△

(1. College of Basic Medicine, 2. Medical Research Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China)

Objective: To explore the role and mechanism of oxidative inflammatory cascade in pancreatic fibrosis progression of chronic pancreatitis(CP) in mice induced by dibutyltin dichloride (DBTC) plus ethanol. Methods: Thirty-six KM mice were randomly divided into 2 groups(n=18):control group and model group(DBTC combined with ethanol). The mice in model group were intravenously injected with DBTC (8 mg/kg) in tail vein and drink 10% ethanol. After modeling 2 weeks, 4 weeks and 8 weeks, the mice were anesthetized and sacrificed, the pathological changes and the degree of fibrosis in the pancreas were observed by HE and Masson staining, the F4/80 expression level were detected by immunohistochemistry, the content of superoxide dismutase(SOD), malondialdehyde(MDA)and myeloperoxidase(MPO)were measured in the pancreatic homogenates. Results: The fibroblasts and macrophages (f4/80 positive staining) could be seen obviously in pancreas of model group at 2 weeks. At 4 weeks and 8 weeks, macrophages infiltration increased and pancreatic tissue was substituted by the proliferation of fibrosis significantly. At every time-point，in pancreatic homogenates SOD was decreased, MDA and MPO markedly increased. There was significant differences between two groups(P<0.05). Conclusion: DBTC injection joint ethanol drinking can successfully establish the model of chronic pancreatitis and pancreatic fibrosis in mice. Oxidative inflammatory cascade plays an important role in the progression of pancreatic fibrosis.

mouse； pancreatic fibrosis； OIC； F4/80； SOD； MDA； MPO

国家自然科学基金(81102725)；陕西省中医药管理局项目(jc10)；陕西省教育厅自然科学基金资助项目(11JK0717，14JK1189)

2015-04-22 【修回日期】2015-06-23

R363

A

1000-6834(2015)05-477-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.024

△【通讯作者】Tel： 029-38183453； E-mail： zhangh1227@163.com