姜黄素对食管癌Ec109细胞增殖和PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响*

李秀娟， 罗 强， 孙 黎， 刘 华， 金春亭， 范 婕△， 李玉珍

(1. 河北北方学院病理教研室， 2. 河北北方学院生命科学研究中心， 张家口 075000)



姜黄素对食管癌Ec109细胞增殖和PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响*

李秀娟1， 罗 强2， 孙 黎2， 刘 华2， 金春亭1， 范 婕1△， 李玉珍1

(1. 河北北方学院病理教研室， 2. 河北北方学院生命科学研究中心， 张家口 075000)

目的：观察姜黄素对食管癌Ec109细胞增殖的抑制作用及肿瘤抑制基因/磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/Akt)信号通路的影响。方法：体外培养人食管癌Ec109细胞，不同浓度姜黄素作用后，MTT法检测其对Ec109细胞的增殖抑制作用，透射电镜观察细胞超微结构，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot法分析肿瘤抑制基因(PTEN)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶-3(GSK3β)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase 3)蛋白的表达情况。结果：MTT检测结果显示姜黄素能显著抑制Ec109细胞的增殖，且呈明显的剂量和时间效应关系；透射电镜观察发现姜黄素能诱导Ec109细胞发生凋亡；流式细胞仪分析显示随药物浓度的增加，Ec109细胞凋亡率明显升高；Western blot结果表明姜黄素可增强细胞中PTEN、GSK3β和Caspase 3的表达，抑制Akt的表达。结论：姜黄素通过上调PTEN、GSK3β和Caspase 3的表达，抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制食管癌Ec109细胞增殖。

姜黄素；PTEN/PI3K/AKT信号通路；食管癌

姜黄素是从植物姜黄根茎中提取的一种植物多酚，由于其抗炎、抗氧化、降血脂、抗动脉硬化及抗肿瘤等广泛的药理作用日益受到研究者的重视[1]。有资料显示[2,3]姜黄素抗肿瘤的作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，但其发挥生物学作用的精确靶点目前还不十分清楚。肿瘤发生过程中抑癌基因PTEN 的突变使其丧失了调节PI3K/Akt通路的能力，细胞增殖失去控制，从而引起癌变。目前在建立的小鼠模型中已经观察到该通路异常所导致的细胞转化和肿瘤发生[4]，但姜黄素诱导食管癌Ec109细

胞凋亡的过程中是否有该通路的参与还不明确。本研究旨在探讨姜黄素是否通过作用PTEN/PI3K/Akt通路诱导食管癌Ec109细胞凋亡，进一步明确姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的作用途径，为其早日应用于肿瘤的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

姜黄素购自美国Sigma公司，纯度≥95%，溶解于二甲基亚枫(DMSO)中配成浓度为10 mmol/L的母液，-20℃避光保存。 MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。PTEN、Akt、GSK3β、Caspase 3和β-actin单克隆抗体均购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞株及细胞培养

人食管癌Ec109细胞由河北北方学院生命科学研究中心提供，细胞复苏后置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5% CO2及湿度饱和的条件下培养。培养基每24小时更换一次，待融合率达到80%时，0.25%胰酶消化、传代，选用状态良好、处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞增殖抑制实验

Ec109细胞胰酶消化收集，显微镜下计数后将细胞浓度调整为5×104cells/ml，以每孔200 μl细胞悬液的量接种于96孔板，置于培养箱中24 h待其贴壁后，分别加入浓度为30、60、90 μmol/L姜黄素，每组设6个复孔，每孔终体积为200 μl，对照组加入等量培养基，培养箱中培养24、48 h。分别加入MTT溶液20 μl/well，温育4 h吸去上清，加入DMSO100 μl/well，置于培养箱中10 min使结晶充分溶解。用酶标仪测定各孔490 nm波长处吸光度(OD值)，计算细胞抑制率(%)=(OD处理组/OD-对照组)×100%，每组实验重复3次，取平均值。

1.4 透射电镜细胞样品制备

制备浓度为1×105cells/ml细胞悬液，以每组两瓶细胞的量接种于50 ml培养瓶中，培养箱中过夜后弃去各瓶培养基，处理组加入30、60、90 μmol/L姜黄素1.5 ml和培养基1.5 ml，使终体积为3 ml，对照组加入等量培养基，24 h胰酶消化收集各瓶细胞及上清于离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗3次，2.5%戊二醛4℃固定，PBS冲洗，置于1%锇酸1.5 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂浸透、包埋，聚合72 h修块、切片、醋酸双氧铀和柠檬铅双染。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡

将浓度为5×104cells/ml细胞悬液以每组一瓶细胞接种于培养瓶中，过夜弃去培养基，处理组分别加入30、60、90 μmol/L姜黄素1.5 ml和培养基1.5 ml，对照组加入等量培养基，24 h消化收集各瓶细胞及上清于离心管中，1 500 r/min离心7 min，弃上清，PBS清洗2次，各管分别加入Binding Buffer 500 μl、 Annexin V5 μl、PI 5 μl，5～15 min内上流式细胞仪(FACSAria，美国BD公司)检测。

1.6 Western blot法检测蛋白

按1.3项方法处理细胞，分别提取对照组和用药组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，变性后-20℃保存。配制分离胶和浓缩胶，灌胶、上样，上样量为50 μg，80 V电压进行电泳，待蛋白样品电泳至下层分离胶时将电压调至120 V，直到溴酚蓝到达分离胶底部，停止电泳。转膜，丽春红染色确定待测蛋白转移情况，5%脱脂奶粉封闭后分别与PTEN、Akt、GSK3β、Caspase 3和β-actin蛋白一抗4℃孵育过夜，PBST漂洗PVDF膜后与二抗室温孵育1 h，清洗、发光、显影，分析结果，计算检测蛋白和β-actin的光密度比值。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 姜黄素对Ec109细胞增殖的抑制作用

30、60、90 μmol/L姜黄素处理Ec109细胞后，细胞增殖均受到不同程度的抑制，与对照组相比，姜黄素作用24 h后，可明显抑制Ec109细胞的生长(P<0.05)，48 h后各药物组的抑制作用更加显著(P<0.01)，且不同剂量的抑制作用比较差异显著(P<0.01)，即姜黄素对Ec109细胞的增殖抑制呈明显的剂量和时间效应关系(表1)。30、60、90 μmol/L姜黄素作用Ec109细胞24 h抑制率分别为(18.2±1.8)%、(34.4±3.9)%和(49.3±2.3)%，故选用姜黄素处理Ec109细胞24 h用于后续各项实验。

Tab. 1 Cell inhibition rate treated with curcumin

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vs30 μmol/L group；△△P<0.01vs60 μmol/L group

2.2 细胞超微结构观察

对照组Ec109细胞状态良好，细胞膜完整，细胞器明显，可见双层核膜结构。姜黄素作用24 h后，各组细胞体积均缩小。30、60 μmol/L组出现线粒体嵴和膜融合，染色质厚薄不均边集于核膜下等凋亡特征。90 μmol/L组粗面内质网脱颗粒，线粒体空泡化，染色质核膜下聚集成半月形，凋亡特征明显(图1)。

2.3 姜黄素对Ec109细胞早期凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示，姜黄素能明显地促进Ec109细胞凋亡。30、60、90 μmol/L用药组细胞早期凋亡发生率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且各剂量组凋亡发生率比较差异显著(P<0.01)，即随着药物浓度的增加，Ec109细胞的凋亡率逐渐升高(表2)。

Fig. 1 Ultrastructure of Ec109 cells were observed by TEM after treated with Curcumin(×8K) A： Control； B： Curcumin at 30 μmol/L； C： Curcumin at 60 μmol/L； D： Curcumin at 90 μmol/L

Tab. 2 Apoptosis rate of Ec109 cells by FCM

*P<0.05vscontrol group；##P<0.01vs30 μmol/L group；△△P<0.01vs60 μmol/L group

2.4 姜黄素对Ec109细胞PTEN、Akt、GSK3β和Caspase 3蛋白表达的影响

Group(μmol/L)PTEN Akt GSK3β Caspase3 Control1.17±0.041.37±0.081.04±0.061.15±0.04301.32±0.06*1.24±0.051.20±0.06*1.39±0.04**601.43±0.08**#0.75±0.04**#1.37±0.10**#1.48±0.08**#901.54±0.03**△0.59±0.07**△1.45±0.07**△1.63±0.10**△

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group；#P<0.05vs30 μmol/L group；△P<0.05vs60 μmol/L group

3 讨论

目前植物提取成分已成为抗肿瘤药物的重要来源，姜黄素便是从植物姜黄中提取的色素[5]，因其抗肿瘤作用日益受到研究者的重视，作用机制有：损伤细胞线粒体，使之释放细胞色素C，活化Caspase 3诱导肿瘤细胞凋亡[6]；抑制肿瘤血管生长因子而抑制肿瘤细胞的生长和转移[7]；阻遏细胞周期，诱导细胞分化[8]；调节多种细胞信号转导途径如Notch-1[9]、TGF-β[10]、NF-κB[11]等抑制肿瘤细胞增殖。但姜黄素是否通过作用PTEN/PI3K/Akt信号通路诱导肿瘤细胞凋亡目前并不十分清楚，因此本实验观察姜黄素对体外培养的人食管癌细胞Ec109增殖和PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响。

Fig. 2 Effect of curcumin on protein expression of PTEN, Akt, GSK3β, Caspase 3 1： Control； 2： Curcumin 30 μmol/L； 3： Curcumin 60 μmol/L； 4： Curcumin 90 μmol/L

本研究结果显示姜黄素能显著抑制食管癌Ec109细胞的增殖，且呈明显的剂量和时间效应关系。透射电镜形态学观察显示随着姜黄素浓度的增加，Ec109细胞凋亡的特征越来越明显。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测，结果表明30、60、90 μmol/L姜黄素作用后细胞凋亡发生率与对照组相比差异显著，该结果进一步说明姜黄素确实能够诱导Ec109细胞凋亡。

为明确姜黄素抑制Ec109细胞增殖，诱导其凋亡的作用途径，本实验采用Western blot法检测了PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白的表达情况。结果显示姜黄素处理癌细胞后，PTEN 、GSK3β和Caspase 3蛋白的表达明显增加，而Akt的表达明显下降。出现这一结果的原因为姜黄素作用癌细胞后上调了抑癌基因PTEN的表达，继而PTEN使PI3K的活化产物PIP3去磷酸化，降低了细胞内PIP3的浓度，从而抑制了Akt的激活，使Akt的表达水平降低[12]。而Akt抑制后使其下游靶基因GSK3β激活[13]，进而调节下游凋亡相关蛋白Caspase 3[14]的表达，所以30、60、90 μmol/L姜黄素处理Ec109细胞后GSK3β、Caspase 3表达均显著升高。综上，本研究结果表明姜黄素通过抑制PTEN/PI3K/Akt信号通路而抑制食管癌细胞Ec109的增殖。

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The effects of curcumin on PTEN/PI3K/Akt pathway in Ec109 cells

LI Xiu-juan1， LUO Qiang2， SUN Li2， LIU Hua2， JIN Chun-ting1， FAN Jie1△， LI Yu-zhen1

(1. Department of Pathology， Hebei North University， 2. Life Sciences Research Center， Hebei North University， Zhangjiakou 075000, China)

Objective: To investigate the inhibition effect of curcumin on the proliferation of the human esophageal carcinoma cell line Ec109 and its impact on PTEN/PI3K/Akt signaling pathway. Methods: Esophageal carcinoma Ec109 cells were cultured in vitro conventionally and were treated with curcumin at different concentrations. The cell proliferation level was examined by MTT colorimetry, the ultrastructure of curcumin-treated Ec109 cells were detected with transmission electron microscope(TEM) and cell apoptosis was observed by FCM with AnnexinV-FITC/PI double staining. The protein levels of PTEN, Akt, GSK3β and Caspase 3 of curcumin-treated Ec109 cells were detected by Western blot. Results: MTT test showed that curcumin could inhibit the proliferation of Ec109 cells in a time and concentration-dependent manner. TEM examination indicated that curcumin could induce Ec109 cell apoptosis. FCM detection showed that Ec109 cell apoptotic rate increased significantly with the increase of drug concentration. On the other hand, curcumin could promote the expression of PTEN, GSK3β and Caspase 3 yet reduce the expression of Akt. Conclusion: Curcumin could obviously up-regulate the expression of PTEN,GSK3β and Caspase 3, surpress PI3K/Akt signaling pathway and hence inhibit the proliferation of Ec109 cells.

curcumin; PTEN/PI3K/Akt pathway; esophageal carcinoma

河北省医学科学研究重点课题计划(ZD20140083)

2015-01-29 【修回日期】2015-06-19

R735.1

A

1000-6834(2015)05-465-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.021

△【通讯作者】Tel： 18931335085； E-mail： fanjie9@sina.com