冠状动脉疾病患者CD36基因多态性与心血管相关因素的关系

赵宁，张慧杰，王建昌



论著·临床

冠状动脉疾病患者CD36基因多态性与心血管相关因素的关系

赵宁，张慧杰，王建昌

目的 研究CD36基因多态性与冠状动脉疾病(CAD)危险因素之间的关系。方法 选择解放军空军总医院<60岁90例CAD患者，抽取患者空腹静脉血检测血红蛋白(Hb)、白细胞(WBC)、单核细胞(M)、嗜碱性粒细胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同时记录患者的体质量、收缩压、舒张压，并计算体质量指数和平均动脉压。利用变性高效液相色谱技术(DHPLC)分析包含内含子片段的外显子4和5的扩增产物，分析基因型和各变量之间的相关性。结果 发现CD36 基因有两种多态性变异：IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A(rs3211892)。其中IVS3-6 T/C多态性的C等位基因与肥胖、糖尿病、血清Lp(α)浓度降低以及心肌梗死发病年龄提前有关。而IVS4-10 G/A多态性的A等位基因与心肌梗死发病较晚和白细胞数量增加有关。结论 CD36的IVS3-6 C等位基因与心血管疾病的危险因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有关，与心肌梗死发病年龄提前有关；而IVS4-10 A等位基因与心肌梗死发病年龄推迟有关。CD36 的多态性在CAD中的作用仍需进一步研究。

基因多肽性CD36；冠心病；心肌梗死

随着生活水平的提高，冠心病的发病年龄已经有低龄化的趋势。近年来遗传因素在冠心病发病机制中的地位越来越引起人们的重视。CD36是一种位于多种细胞(血小板、内皮细胞、巨噬细胞、树突细胞、脂肪细胞、横纹肌细胞、造血干细胞等)表面的B型清除受体。其介导的主要功能涉及到脂质利用、胰岛素抵抗、炎性反应、动脉粥样硬化和血栓的形成，在动脉粥样硬化中起重要作用，在白种人中的研究发现CD36 基因多态性与心血管疾病的风险具有明显的相关性，特别是游离于循环系统的单核细胞CD36 mRNA的表达可能是发生冠状动脉疾病高风险的一个标志，但目前还没有直接证据证明CD36基因突变能降低或增加高血脂、动脉硬化及其并发症(血管功能障碍、高血压、缺血性心脏病)的风险[1～3]，而且CD36基因是否在汉族人群中存在多态性目前还没有报道，为了解决这些问题，我们观察了其基因多态性中CD36 基因编码氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和脂酸结合结构域区域的序列变化与冠状动脉疾病(CAD)已知的危险因素之间的关系，为冠心病的早期诊断、危险人群的筛选和基因治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2007年1月—2010年12月在我院就诊的60岁以下CAD患者90例。纳入标准：临床状况稳定，无急性冠状动脉症状，在近期(1年内)没有进行血管再通术治疗。排除标准：有先天性血液动力学紊乱或获得性心脏瓣膜病，有症状心力衰竭 (NYHA>1级), 肾衰竭(肌酐>265 μmol/L),1型糖尿病, 甲状腺功能不全, 恶性肿瘤。CAD诊断主要通过冠状动脉血管造影，符合下列特征之一即可确定诊断：(1)左冠状动脉狭窄程度≥40%；(2)心外膜下3个主要侧支之一狭窄程度≥50%；(3)动脉分支狭窄程度≥70%。该试验完全遵循赫尔辛基宣言并获得我院伦理审查委员会的批准，试验前所有患者均签署知情同意书。

1.2 观察指标和方法 抽取患者空腹静脉血检测血红蛋白(Hb)、白细胞(WBC)、单核细胞(M)、嗜碱性粒细胞(B)、空腹血糖(FPG)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及三酰甘油(TG)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)和脂蛋白(α)[(Lp(α)]。同时记录患者的体质量、收缩压、舒张压，并计算体质量指数和平均动脉压。

1.3 基因检测 空腹状态下取肘部静脉血3 ml促凝离心后取上清液，-80℃保存。分离血细胞目标基因组DNA[4]，具体步骤参考AxyPrep血液全基因组DNA小量提取试剂盒说明书；使用变性高效液相色谱(DHPLC)技术研究包含内含子片段的外显子4和5的扩增产物[5]。通过DHPLC 检测PCR产物的变化，并使用Applied Biosystems公司的染料终止子循环测序反应试剂盒对其进行双向测序。使用373A DNA片段分析仪进行半自动序列分析(Applied Biosystems, Foster City, CA)。

1.4 统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析，根据CD36 基因型将病例分组，计量资料使用Mann-Whitney U 检验和t检验，使用精确检验评估Hardy-Weinberg平衡下的基因型分布的一致性。计算比值比 (OR)及其95%可信区间(95%CI)，分析基因型和定性变量之间是否有显著的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD36基因多态性 DHPLC检测到的变异主要包括内含子中2个单核苷酸替换(多态性),即IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892)，外显子中并未发现序列改变。2种序列变异在Hardy-Weinberg平衡下基因型分布一致(P=1)。说明实验选取的样本基因型可以稳定遗传，可以代表整个群体。见表1。

表1 患者CD36基因多态性

2.2 不同CD36 基因型患者的临床参数比较 IVS3-6 TC杂合子患者较TT纯合子患者体质量指数稍高，肥胖明显(BMI≥30 kg/m2) (OR=2.93,95%CI 0.98～8.76,P=0.07)。糖尿病发病率高(OR=6.09,95%CI 1.66～22.32,P=0.01),既往心肌梗死患者中，TC基因型患者的心肌梗死发病年龄提前(OR=1.346，95%CI 0.528～3.429，P=0.057)。相反，IVS4-10 GA杂合子患者比野生型GG纯合子心肌梗死首次发病年龄要晚(OR=3.453，95%CI1.532～7.786，P=0.003)。见表2。

2.3 不同CD36基因型患者的血细胞数和生化数据比较 IVS3-6 TC 杂合子白细胞中嗜碱性粒细胞的比例比TT患者低(OR=5.21,95%CI 2.464～11.3，P=0.03)。IVS3-6 TC基因型hs-CRP较TT基因型高(OR=2.93,95%CI 1.8～9.6,P=0.02)，Lp(a)低(OR=5.039，95%CI 2.173～11.883，P=0.01)。IVS4-10 GA基因型白细胞数更高(OR=2.17, 95%CI 1.05～4.57，P=0.03)。见表3。

3 讨 论

随着人们生活水平提高、人口老龄化加重及城市化发展进程加快，冠心病及其相关并发症的发病率在逐年提高，已经成为影响健康的首要疾病。近年来，对于冠心病发生相关基因水平的研究已越来越受到人们的重视[6]，并发现了大量与心血管疾病发生相关的单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphism,SNP)，这些方法为冠心病诊断提供方便可行的分子标记，以早期预测高风险人群并指导预防和治疗[7～9]。在本研究中，我们发现中国人CD36内含子片段中有IVS3-6 T/C (rs3173798)和IVS4-10 G/A (rs3211892)2种多态性[10]，2种变异均与心脏疾病的发生有关。IVS3-6 TC 和IVS4-10 GA基因型与心肌梗死发病年龄之间也存在相关趋势(P=0.057)或显著相关性(P=0.003)，但相关性相反：TC杂合子首次发病的年龄更小，而GA杂合子首次发病年龄更大。此外IVS3-6 TC杂合子与3种心血管危险因素有关，分别为hs-CRP、肥胖发病率、糖尿病史[11]，其中IVS3-6 TC 杂合子比野生型纯合子患者更易患2型糖尿病，但各组间空腹血糖并无差异，分析原因可能是由于多数TC杂合子的糖尿病患者口服降糖药或使用胰岛素所致。而IVS4-10 GA杂合子患者中2型糖尿病的发病率与野生型没有差别。在国外同类研究中Leprêtre等[11]指出白种人CD36的IVS4-10 G/A变异与脂类代谢水平之间有相关性，Love-Gregory等[12]研究了有高血压的非裔美国人中发现的所有的CD36 序列变异(内含子3中的rs3211850；内含子9中的rs3173804；外显子10中的无义突变rs3211938；3′ UTR中的rs7755, rs13246513和rs13230419)均与体格参数(BMI>30 kg/m2，腰围>100 cm)相关，白种人rs1527479 CD36 启动子多态性与胰岛素抗性和2型糖尿病有关。这些研究和我们的结论基本是一致的。最新的研究还提出在非裔美国人中CD36 多态性可能会导致血浆HDL-C浓度增加[13]，在有文献报道成人双生子登记队列中CD36启动子多态性rs2151916与LDL-C水平有关：次要等位基因纯合子患者 LDL-C水平更低[14]。内含子11中的1种多态性(rs1527483)和3′UTR 区(外显子14和15)的2种多态性(rs3840546, rs1049673)与血浆游离脂肪酸代谢有关。但在我们的试验观察到2种基因型间血脂浓度没有显著差异，这主要是因为我们试验中几乎所有病例均服用了他汀类药物，影响试验结果[15]。但另一方面我们还发现IVS3-6 TC基因型与Lp(a)降低有关, 这可能是动脉粥样硬化疾病(如冠心病和中风)的危险因素。非洲人的外显子10纯和无义突变(rs3211938)与血红蛋白水平提高有关。在我们的试验中并未发现不同组间血红蛋白水平存在差异，却发现IVS4-10 GA 杂合子患者的白细胞数量更多。目前尚没有这种相关性报道的出现，其临床意义还有待进一步研究。

表2 不同CD36 基因型患者的临床资料比较

表3 不同CD36基因型的生化指标比较

总之，CD36的IVS3-6C等位基因的多态性与心血管疾病的危险因素(如hs-CRP、BMI和2型糖尿病)有关。IVS3-6 C等位基因与心肌梗死发病年龄提前有关，而IVS4-10 A等位基因与心肌梗死发病年龄推迟有关。基因的这种突变对冠状动脉疾病的风险以及临床病程的功能性意义，还需要进一步的评估。

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4 Lahiri DK,Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,2003,31(4):321-328.

5 Raá ME，Safranow K,Poncyliusz W.Molecular basis of human CD36 gene mutations[J].Mol Med,2009,13(5):288-296.

6 Knowles JW,Wang H,Itakura H,et al.Association of polymorphisms in platelet and hemostasis system genes with acute myocardial infarction[J].Am Heart J,2007,154(6):1052-1058.

7 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

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9 杨俊平，方五旺，贾永平，等.血管紧张素转换酶和血管紧张素原基因多态性与冠心病的关系[J].中国心血管病研究，2013，11(8)：600-604.

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11 Leprêtre F,Linton KJ,Lacquemant C,et al.Genetic study of the CD36 gene in a French diabetic population[J].Diabetes Metab,2008,30(3):459-463.

12 Love-Gregory L,Sherva R,Sun LW,et al.Variants in the CD36 gene associate with the metabolic syndrome and high-density lipoprotein cholesterol[J].Hum Mol Genet,2008,17(11):1695-1704.

13 Ra ME,Suchy J,Kurzawski G,et al.Analysis of human CD36 gene sequence alterations in the oxLDL-binding region performed by denaturing high-performance liquid chromatography[J].Genet Test Mol Biomarkers,2010,14(5):551-557.

14 Silverstein RL.Inflammation, atherosclerosis, and arterial thrombosis: role of the scavenger receptor CD36[J].Cleve Clin J Med,2009,76(Suppl 2):S27-S30.

15 Teupser D,Mueller MA,Koglin J,et al.CD36 mRNA expression is increased in CD14+ monocytes of patients with coronary heart disease[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2008,35(5/6):552-556.

撰写医学论文主体部分的要求

1 前言 概述研究的背景、目的、研究思路、理论依据、研究方法、预期结果和意义等。仅需提供与研究主题紧密相关的参考文献，切忌写成文献综述。不要涉及本研究中的数据或结论。一般以200～300个汉字为宜，占全文字数的5%左右。

2 方法 描述研究对象(人或实验动物，包括对照组)的选择及其基本情况，以及研究所采用的方法(包括分组方法)。实验研究的论文常写成“材料与方法”，临床研究论文常写成“资料与方法”。临床试验研究还应说明试验程序是否经所在单位或地区伦理学相关机构的批准，研究对象是否知情同意并签署知情同意书。

2.1 观察对象： 观察对象为患者，需注明病例和对照者来源、选择标准、一般情况、观察指标和疗效判断标准等。研究对象为实验动物，需注明动物的名称、种系、等级、数量、来源、性别、年龄、体重、饲养条件和健康状况等。

2.2 研究方法： 详述新创的方法及改良方法的改进之处，以备他人重复。采用他人方法，应以引用文献的方式给出方法的出处，无须详细描述。

2.3 药品与试剂： 药品及化学试剂使用通用名称，并注明剂量、单位、纯度、批号、生产单位、生产时间及给药途径。

2.4 仪器、设备： 应注明名称、型号、规格、生产单位、精密度或误差范围。无须描述工作原理。

2.5 统计学处理： 描述统计学方法及其选择依据, 并说明所使用的统计学软件。

3 结果 “结果”是指实验所得数据、观察记录，经过综合分析和统计学处理的结果，而不是原始数据，更不是原始记录。按逻辑顺序在正文的文字、表格和图中描述所获得的结果。结果的叙述应实事求是，简洁明了，数据准确，层次清楚，逻辑严谨，不应与讨论内容相混淆。应着重总结重要的研究结果。以数据反映结果时，应注意不能只描述导数(如百分数)，还应同时给出据以计算导数的绝对数。一般应对所得数据进行统计学处理，并给出具体的统计值，例如：t= 2.85，P<0.01。

4 讨论 “讨论”是对研究结果的科学解释与评价，是研究所形成的科学理论。着重讨论研究结果的创新之处及从中导出的结论，包括理论意义、实际应用价值、局限性，及其对进一步研究的启示。如果不能导出结论，也可通过讨论，提出建议、设想、改进意见或待解决的问题等。应将本研究结果与其他有关的研究相比较，并将本研究结论与目的联系起来讨论，并列出相关参考文献。不必重述已在前言和结果部分详述过的数据或资料。不应列入图或表。

Polymorphism of CD36 gene and cardiovascular risk factors in patients with coronary artery disease

ZHAONing,ZHANGHuijie，WANGJianchang.DepartmentofInternalMedicine,AirForceGeneralHospital,PLA,Beijing100142,China

Correspondingauthor:WANGJianchang,E-mail：1084292231@qq.com

Objective To investigate the relationship between CD36 gene polymorphism and coronary artery disease (CAD)’s risk factors.Methods 90 CAD patients aged <60 were collected, hemoglobin (Hb), white blood cell (WBC), mononuclear cells (M), basophils (B),fasting blood glucose (FPG), high sensitive C reactive protein (hs-CRP), total cholesterol (TC), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglyceride(TG),apolipoprotein A1(ApoA1), ApoB and lipoprotein (α) [Lp (α)]were detected. At the same time recording quality, systolic pressure, diastolic pressure volume of patients, and calculated the body mass index and mean arterial pressure. Using denaturing high performance liquid chromatography to analyze intron fragment containing exon 4 and exon 5’s amplicon, analyzed the correlation between the genotype and the variables.Results There are two kinds of polymorphism of CD36 gene: IVS3-6 T/C (rs3173798) and IVS4-10 G/A (rs3211892).The IVS3-6 T/C polymorphism of C alleles was correlated with obesity, diabetes, serum Lp (a) concentration decreases and the early age onset of myocardial infarction. While the number of IVS4-10 G/A polymorphism of A alleles was related to late myocardial infarction and increase of white blood cell.Conclusion CD36’s IVS3-6 C allele was correlated with the risk factors of cardiovascular disease (such as hs-CRP, BMI and type 2 diabetes mellitus), and correlated with early age onset of myocardial infarction; while the IVS4-10 A allele was correlated with late age onset of myocardial infarction. The role of CD36 polymorphism in CAD is still needs further research.

Gene polymorphyism，CD36;Coronary heart disease; Myocardial infarction

100142 北京，解放军空军总医院心脏中心

王建昌，E-mail：1084292231@qq.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.05.004

2014-07-09)