增龄对兔心房及肺静脉肌袖组织缝隙连接蛋白的影响

李侠 王文革 陈方圆

增龄对兔心房及肺静脉肌袖组织缝隙连接蛋白的影响

李侠 王文革 陈方圆

目的通过研究家兔心房及肺静脉肌袖连接蛋白的增龄性改变，探讨增龄与房颤的关系。方法以家兔为研究对象，分离不同年龄组家兔心房及肺静脉肌袖组织，用免疫组化的方法检测心房及肺静脉肌袖连接蛋白Cx43和Cx40的表达。结果随着年龄增加，心房及肺静脉肌袖组织Cx43的表达量呈明显的下降趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论兔心房及肺静脉肌袖连接蛋白存在增龄性改变，可导致房颤的发生。

增龄；肺静脉肌袖；连接蛋白；心房颤动

心房颤动（房颤）是一种年龄相关性心律失常，发病率随年龄的增长而显著增加，50～59岁组人群中房颤的患病率＜1%，而80～84岁组上升至10%，＞85岁人群为11%～18%［1⁃2］。随着年龄的增加，心脏的大体结构及传导系统发生着相应的变化，心肌组织本身存在着增龄性结构重构和电重构［3］。心房组织特别是其一些特殊结构是否也存在增龄性变化？这些变化有什么规律？有关这些方面的研究，可能对增龄相关的以房颤为主的房性心律失常的发病机制的揭示有着重要的意义。本实验以家兔为研究对象，分离不同年龄组家兔心房及肺静脉肌袖组织，检测缝隙连接蛋白（connexin，Cx）的表达，探讨增龄与房颤的关系，为增龄是否是房颤发生的主要或独立危险因素提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物分组 健康家兔按月龄分为幼龄组（5～10 d）、中龄组（4～6月）、老龄组（30～34月），每组各6只［4］。幼龄、中龄兔购于西安交通大学实验动物中心，老龄兔购于陕西省闫良种兔场。

1.2 免疫组织化学染色 家兔开胸，分离肺静脉及左右心房组织。把取得的肺静脉及左右心房组织块分别放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋制备石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，室温3%H2O2处理5 min，以灭活内源性酶，微波修复抗原，滴加5% BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗，每只家兔取2张心肌切片适当滴加1∶400稀释的Cx40多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），另2张切片滴加1∶350稀释的Cx43抗体（武汉博士德试剂公司），置于冰箱中4℃过夜。PBS洗2 min×3次。滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃1 h，PBS缓冲液清洗2 min×3次。滴加链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（streptavidin biotin complex，SABC）试剂，37℃20 min，PBS清洗5 min×4次。二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。每2张切片中的1张再经苏木素轻度复染，用于观察Cx40及Cx43的分布。光镜下Cx40、Cx43阳性着色均表现为棕黄色颗粒。

1.3 图像分析 每张组织切片上采用OLYMPUS倒置显微成像系统随机选择5个视野，每个视野拍摄5幅照片。用Image⁃Pro Plus 6.0图像分析软件对所采集的图象进行分析。免疫组化切片测定每个视野下阳性物质的累积光密度（integrated optical density，IOD），对家兔Cx40、Cx43的光密度参数进行半定量分析。

1.4 统计学处理 所有数据均采用均数±标准差（¯x± s）表示，用SPSS 13.0软件分析数据。3组均数的比较采用单因素方差分析，若3组之间差异有显著性，则进行两两比较，两两比较用LSD⁃t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

随着增龄，左、右心房和肺静脉肌袖组织Cx43的表达量均呈现明显的下降趋势（P＜0.05）。见表1。在左、右心房组织内Cx40表达量随着增龄有明显减少的趋势（P＜0.05），但肺静脉肌袖组织内Cx40表达很弱，变化不明显，各年龄组间比较无统计学差异。见表2。各组家兔Cx43、Cx40免疫组化染色如图1～6（封二）所示。

表1 3组家兔心房和肺静脉肌袖Cx43 IOD比较（¯x±s，n＝6）

表2 3组家兔心房和肺静脉肌袖Cx40 IOD比较（¯x±s，n＝6）

3 讨论

心肌细胞间连接处的闰盘中有特化组织，称之为缝隙连接（gap junction，GJ），GJ允许动作电位从一个细胞扩布到邻近的另一个细胞，是含有多种细胞间通道的特殊膜结构，由Cx所构成，研究提示Cx的变化可能与一些心律失常有关［5⁃6］。心房的GJ主要存在于闰盘，是心肌细胞端⁃端连接的特有结构［7］。研究证实肺静脉肌袖是人类心脏正常结构的一部分，心肌袖内同样也有Cx表达［8］。

家兔左、右心房肌均有Cx43和Cx40的表达，同年龄组左、右房Cx43表达量多于Cx40，说明Cx43是心房主要的连接蛋白。肺静脉肌袖主要表达Cx43，说明Cx43是肺静脉肌袖主要的连接蛋白；而为何肺静脉肌袖Cx40的表达极差。既然肺静脉肌袖组织在解剖上是心房肌的延续，而为何在表达Cx方面存在差异呢？这可能正是局灶性房颤起源于肺静脉的机制之一，仍需要进行进一步研究。

本研究发现，随着增龄，心房及肺静脉心肌细胞中Cx43和Cx40的表达逐渐减少。增龄引起肺静脉肌袖细胞Cx表达降低，导致细胞间电耦联性的进一步下降，改变了心肌的电传导性，使传导速度减慢或发生传导阻滞的程度加重，易于形成折返［9⁃10］。由于折返的波长等于传导速度与不应期的乘积，增龄引起的Cx重构使传导速度减慢，从而进一步使折返的波长缩短，易于在缓慢传导区内形成多个微小折返子波。Cx表达水平越低，相邻心肌之间的这种传导性能的差异可能越明显，这样就容易形成引起房颤的折返环路。研究表明，房性心律失常都需要解剖基础上的冲动不连续传导，其范围决定心律失常的类型，这种解剖基础就是Cx表达量和分布上的增龄性变化［11⁃12］。心房内或者肺静脉内都可以同时存在多个小的折返环，也可以存在少数几个大的折返环，当折返环范围小到一定程度时，单个大折返环在一定程度上变得不稳定，或者分裂成数个小折返环，折返环进一步减小并弥散时，即可导致细颤。

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Effect of aging on connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit

LI Xia．Department of VIP Internal Medi⁃cine；WANG Wen⁃ge．Department of Nephrology，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China；CHEN Fang⁃yuan．Department of Cardiovascular Medicine，Fist Affiliated Hospital of Medical College，Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectiveTo investigate the relationship between aging and atrial fibrillation by studying the age⁃related changes of the expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium in rabbit.MethodsEighteen healthy rabbits were divided into three groups by age，the chests of the rabbits were opened and the pulmonary vein sleeve were dislodged. The expression of Cx43 and Cx40 were detected by immunohistochemical staining.ResultsThe expression of Cx43 of pulmonary vein sleeve and atrium was statistically decreased with the aging（P＜0.05）.ConclusionsThe expression of connexin of pulmonary vein sleeve and atrium presents with age⁃related changes，which may lead to atrial fibrillation.

aging；pulmonary vein sleeves；connexin；atrial fibrillation

R 541.75

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.01.008

2014⁃03⁃24）

730030甘肃省兰州市，兰州大学第二医院VIP内科（李侠）；肾病内科（王文革）；710061陕西省西安市，西安交通大学医学院第一附属医院心血管科（陈方圆）