睾酮对自发性高血压大鼠动脉功能和结构的影响

易东 孙荣 魏盟 谈世进

·论 著·

睾酮对自发性高血压大鼠动脉功能和结构的影响

易东 孙荣 魏盟 谈世进

目的研究睾酮对自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）血管功能和结构的影响。

方法将各18只10周龄的SHR及WKY大鼠（Wistar⁃Kyoto rats）进行卵巢切除，并随机分为卵巢切除组（ovariec⁃tomized，OVX），卵巢切除后雌激素补充组（OVX＋EB组）和卵巢切除后雄激素补充组（OVX＋TP组），给予相应的激素干预8周。8周末，处死大鼠，HE染色观察胸主动脉病理改变。DMT微血管张力测定仪检测肠系膜动脉乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）和硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）对苯肾上腺素（phenylephrine，PE）诱导的血管舒张作用。

结果补充雌激素能显著改善卵巢切除的WKY和SHR大鼠肠系膜动脉对Ach诱导的血管舒张，与SHR＋OVX组相比，SHR＋OVX＋TP组大鼠肠系膜动脉对Ach诱导的血管舒张作用明显减弱，而WKY＋OVX＋TP组和WKY＋OVX组间的差别则相对较小。各组大鼠对SNP的反应差异无统计学意义，表明睾酮可以减弱WKY和SHR大鼠内皮依赖性舒张，且以对SHR的影响更显著。睾酮干预可以促进SHR平滑肌增生肥大。结论生理剂量的睾酮可以引起SHR大鼠肠系膜动脉内皮功能紊乱，诱导SHR大鼠平滑肌增生肥大，睾酮引起的血压升高可能是其机制之一。

雄激素；雄激素受体；动脉；功能；结构

近年来，心血管疾病呈现持续高发状态，且有上升趋势，严重影响人们的身心健康和生活质量［1］。研究发现，尽管目前各国心血管疾病的发病率差异较大，但女性的心血管疾病的发生率较年龄相仿的男性高，且绝经后女性发病率明显升高［2］。提示性别是心血管疾病独立的危险因素，性激素在心血管疾病中有重要作用。

既往心血管疾病的性别差异的研究主要集中于雌激素的作用，大部分研究认为雌激素对心血管系统起保护作用［3］。在普通、老年、高盐饮食等多种大鼠模型的研究中均发现了血管结构和功能损伤的性别差异，并对其机制进行了广泛而深入的探索［2⁃4］，雌激素可以和雌激素受体相结合，激活内皮型一氧化氮合酶（NOS），促进一氧化氮（NO）合成和释放，舒张血管，抑制脂质过氧化，降低氧化应激，抑制血管间质纤维化，减少血管硬化，抑制炎症反应，发挥心血管保护作用。而雄激素对心血管作用的相关研究则相对较少且多有争议，本研究通过对卵巢切除自发性高血压大鼠（SHR）补充生理剂量的睾酮，以观察雄激素对SHR动脉功能和结构影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10周龄的无特定病原体级（SPF级）SHR及WKY大鼠各18只，体质量（120±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要试剂 丙酸睾酮（中国药品生物制品检定所），苯甲酸雌二醇（中国药品生物制品检定所），睾酮、雌二醇、孕酮均由碧云天生物研究所提供。

1.3 主要仪器 电子天平，高速低温离心机，切片机（德国SLEE公司型号CUT5062），显微镜，酶标仪（美国BioTek公司型号ELx800），离体微血管张力测定系统（丹麦DMT公司，型号DMT 620M）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验模型与分组：将各18只SHR及WKY大鼠随机分为3个亚组：卵巢切除组（ovariectomy，OVX）、卵巢切除后雌激素补充组（OVX＋EB）及雄激素补充组（OVX＋TP），每组6只，其中OVX组作为阴性对照，OVX＋EB作为阳性对照。为区分WKY及SHR大鼠，各组名称分别记为：WKY＋OVX组；WKY＋OVX＋EB组；WKY＋OVX＋TP组；SHR＋OVX组；SHR＋OVX＋EB组；SHR＋OVX＋TP组。适应性喂养2周后进行卵巢切除［5］，并开始药物干预。

1.4.2 动物饲养与给药：所有大鼠均给以标准饲料喂养，自由摄食，自由饮水，OVX＋EB组给予苯甲酸雌二醇0.25 mg／（kg·2d）肌肉注射，OVX＋TP组给予丙酸睾酮3 mg／（kg·2d）肌肉注射［6］。OVX组给予肌肉注射相同体积的注射用茶油，均持续8周。8周末测定大鼠血清性激素水平，均对应地升高。测定尾动脉收缩压，结果显示补充雌激素的SHR和WKY大鼠动脉压较OVX组明显降低；而补充雄激素的SHR和WKY大鼠动脉压较OVX组明显升高［7］。

1.4.3 大鼠肠系膜动脉对乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）和硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）的反应性测定：处死大鼠后，分离、固定肠系膜动脉，采用DMT血管肌力测定仪检测血管功能。用含有60 nmol／L的氯化钾的PSS溶液激活，直至相邻2次血管收缩峰值相差＜20%。然后用累计浓度为10－9～10－5mol／L的苯肾上腺素（polyethylene，PE）收缩血管，直至血管最大收缩峰值达到高钾收缩峰值的80%～120%，再用累计浓度为10－9～10－5mol／L的Ach舒张血管。然后，用加热的PSS液清洗直至血管张力恢复基线，再次用PE收缩血管，再用累计浓度为10－10～10－6mol／L的SNP舒张血管；大鼠肠系膜动脉的反应性用该血管活性物质某一浓度下的肌张力值／PE预收缩的最大值，动脉对药物的最大舒张值记作Dmax，血管达到最大舒张值50%时的药物浓度记作EC50，DMT血管肌力测定仪自带软件分析系统可以自动进行曲线拟合并计算pD2＝－Log EC50，该值与血管对药物活性物质的反应性成正比。

1.4.4 大鼠主动脉结构改变的观测：处死大鼠，收集血样后，留取胸主动脉标本，分离周围结缔组织，10%中性福尔马林溶液固定。石蜡包埋，普通切片机切成10μm的薄片，HE染色，显微镜高倍镜下观察弹力纤维的改变及胶原纤维的增生情况。

1.5 统计学处理 所有计量实验结果以¯x±s表示，数据分析采用SPSS 19.0统计软件。WKY和SHR不同处理间的均数比较采用双因素方差分析（two⁃way ANOVA），满足方差齐性的多重比较采用LSD法，不满足方差齐性的两两比较采用近似t检验。不同品种大鼠同一处理间的比较采用成组t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肠系膜动脉对Ach和SNP诱导的血管舒张反应比较 从图表中大鼠肠系膜动脉对Ach的反应性曲线趋势、Dmax和pD2来看，SHR各亚组大鼠肠系膜动脉对Ach诱导的血管舒张均比对应WKY组明显减弱（P＜0.05）。补充雌激素能显著改善卵巢切除SHR和WKY大鼠肠系膜动脉对Ach诱导的血管舒张作用（P＜0.05或P＜0.01）。与SHR＋OVX组相比，SHR＋OVX＋TP组大鼠肠系膜动脉对Ach诱导的血管舒张明显减弱，而WKY＋OVX组和WKY＋OVX＋TP组间的差别则相对较小。各组大鼠对SNP的反应差异均无统计学意义，表明睾酮可以减弱WKY和SHR大鼠内皮依赖性舒张，且以对SHR的影响更显著。见图1和表1。

图1 各组大鼠肠系膜动脉对Ach（图A）和SNP（图B）诱导的血管舒张

表1 各组大鼠肠系膜动脉对Ach和SNP诱导的血管舒张相关参数比较（¯x±s）

2.2 各组大鼠主动脉结构改变 为检测睾酮对大鼠SHR血管结构的影响，取大鼠胸主动脉进行石蜡切片并HE染色，显微镜下观察，结果如图2（封二）所示。图中能清晰地显示主动脉的平滑肌肌层，部分切片可以显示内皮层。大体看SHR组动脉平滑肌层厚度较对应WKY大鼠轻度增厚。和对应的OVX组相比，睾酮干预对平滑肌基层的厚度无明显影响，但可见肌束明显致密、肥厚、走行稍显紊乱，肌层染色加深，但无明显离断，尚无明显间质增生。睾酮干预组大鼠动脉结构变化以SHR组更为明显。而雌激素补充组则与睾酮干预组相反，肌束完整，走行整齐，染色较淡。可见，睾酮可以干预并轻度促进SHR平滑肌增生肥大，但尚无明显病理损伤改变。

3 讨论

本研究发现睾酮可以引起SHR动脉不同程度的功能和结构损伤，与既往多种大鼠模型的研究均发现睾酮引起动脉结构和功能损伤相一致［4，8］。补充睾酮能显著升高SHR及WKY大鼠血压［7］，可能是雄激素促进肾脏和动脉功能和结构损伤的机制之一。

近年来雄激素替代治疗（androgen replacement therapy，ART）越来越广泛地被应用于临床，如先天性性腺发育不良、慢性肾功不全引起的贫血、急性冠脉综合征以及老年人性功能不全［9⁃10］。然而，由于补充雄激素有诱发或加重老年男性前列腺肥大或前列腺癌的风险［9］，ART广泛用于老年男性受到了制约。近年来ART越来越多地用于女性上述疾病的治疗，其安全性引起了人们的关注。我们的研究采用了雌性大鼠，同时因为18周龄的大鼠已经开始进入绝经期，其激素水平波动较大，本研究统一采取卵巢切除然后补充对应的激素，以保证基础激素水平的一致性，本研究各组大鼠最终的激素水平和既往的研究相接近［6，11⁃12］。

离体微血管功能检测的广泛应用提高了血管功能检测的敏感性和可行性，但国内尚未大范围应用。本文采用大鼠肠系膜二级动脉，测定动脉对Ach和SNP的反应性，由于Ach可以直接诱导血管内皮细胞释放NO，诱导血管舒张，而SNP则直接分解释放NO，故其可以用于检测睾酮对大鼠动脉功能有无影响及是否为内皮依赖性。本研究发现睾酮可以减弱Ach诱导的血管舒张，但对SNP诱导的血管舒张无显著改变，表明睾酮抑制血管舒张，且这一作用呈内皮依赖性，这与近年的研究结果相一致［13］，但是也有大量研究表明雄激素可以促进血管舒张［11⁃12］，可能与选定的实验对象不同有关。本研究采用的剂量对雌性大鼠可能是超生理剂量的。雄激素对大鼠动脉功能影响的具体机制较为复杂，本研究未作进一步深入探讨。既往的研究表明其作用可能与血流动力学的影响、eNOS⁃NO系统的调节和氧化应激的调控有关。

既往的研究表明雄激素对血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和凋亡有广泛的影响。雄激素可以与其受体结合，时间和剂量依赖性地上调血管内皮生长因子和细胞周期蛋白A的表达，增加细胞数和DNA的合成，从而促进内皮细胞增殖［14］。雄激素还可以通过激活丝裂原激活蛋白激酶途径，诱导血管平滑肌细胞有丝分裂［15］。而本研究的结果也表明睾酮可以促进SHR平滑肌增生肥大。

本实验中补充睾酮可以促进SHR大鼠SBP升高，既往大量的研究都支持这一结论［16⁃18］。雄激素引起血压升高可能是引起血管内皮功能紊乱和平滑肌增生肥大的机制之一，雄激素可能通过上述多种机制影响血流动力学、内皮eNOS⁃NO系统以及平滑肌的增殖，但是本研究并不能确定其因果关系。

总之，生理剂量的睾酮可以导致SHR大鼠肠系膜动脉内皮功能紊乱，诱导SHR大鼠平滑肌增生肥大，同时睾酮干预伴随着血压的升高，动脉SBP的升高是其可能的机制之一，但雄激素引起SHR大鼠肾脏和动脉功能和结构改变的确切机制还有待更深入的研究。

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Effect of testosterone on artery function and structure in spontaneously hypertensive rats

YI Dong，SUN Rong，TAN Shi⁃jin．．
Department of Geriatrics；WEI Meng．Department of cardiology，Shanghai Jiaotong University Affiliated Sixth People's Hospital，Shanghai 200233，China

ObjectiveTo investigate the effect of testosterone on artery function and structure in spontaneously hy⁃pertensive rats（SHR）.MethodsEighteen SHR and 18 Wistar⁃Kyoto rats（WKY）of 10 weeks old were ovariectomized and assigned to three groups randomly：ovariectomized（OVX）group，estrogen supplement after ovariectomy（OVX＋EB）group and androgen supplement after ovariectomy（OVX＋TP）group.The rats accepted intramuscular injection of tea oil 0.5 m l／（kg·2d），estradiol benzoate（EB）0.25 mg／（kg·2d）and testosterone propionate（TP）3 mg／（kg·2d）respec⁃tively for 8 weeks.At last，all the rats were killed，blood and tissue samples were collected，and HE staining in artery was performed to observe pathological changes.The relaxation response of rats mesenteric artery preconstricted by phenylephrine（phenylephrine，PE）to acetylcholine（Ach）or sodium nitroprusside（SNP）were test with the help of DMT.ResultsEstrogen replacement therapy can significantly improve Ach⁃induced vasodilation in ovariectomized WKY and SHR.Com⁃pared with SHR＋OVX，the mesenteric artery vasodilation induced by Ach in SHR＋OVX＋TP group were much weaker，while the difference between WKY＋OVX＋TP and WKY＋OVX was relatively smaller.The difference of rat mesenteric arter⁃ies response to sodium nitroprusside was not statistically significant.These results indicate that testosterone may weaken en⁃dothelium⁃dependent relaxation of WKY and SHR rats，especially for SHR.Testosterone can promote smooth muscle hyper⁃trophy of aorta in SHR＋OVX＋TP mildly，but there were no significant pathological changes.ConclusionsPhysiological dose of testosterone can lead to mesenteric artery endothelial dysfunction and induce hypertrophy of smooth muscle in SHR rats.Elevated blood pressure is one of the possible mechanisms.

androgen；androgen receptor；artery；function；structure

R 544.1；R 977.12

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.01.006

2014⁃04⁃03）

上海交通大学医工交叉课题（YG2010MS35）

200233上海市，上海交通大学附属第六人民医院老年病科（易东，孙荣，谈世进）；心内科（魏盟）

谈世进，Email：tanshijinsh＠163.com