质谱仪在真菌鉴定中的应用与评价

王欢，贾天野，鲍春梅，张成龙，张鞠玲，崔恩博，陈素明，徐东平，曲芬

质谱仪在真菌鉴定中的应用与评价

王欢，贾天野，鲍春梅，张成龙，张鞠玲，崔恩博，陈素明，徐东平，曲芬

目的探讨质谱仪在真菌感染中的应用，评价其鉴定真菌的能力。方法选取分离自我院住院患者的真菌菌株327株，用质谱仪进行快速鉴定，并与VITEK-2（酵母样真菌）和显微镜检查（丝状真菌）的鉴定结果进行比对，差异结果用分子生物学方法确认鉴定。结果依照质谱仪评分标准，227株酵母样真菌在种水平（>2.0）的鉴定率为90.31%，在属水平（>1.7）为98.68%；丝状真菌在种水平的鉴定率为74.00%，在属水平为94.00%。对临床常见的曲霉菌鉴定正确率可达96.74%。结论质谱仪在鉴定真菌的种属水平上都达到了令人满意的结果，尤其鉴定酵母菌和曲霉菌的能力更为突出，可作为临床实验室的常规检测方法。

光谱法，质量，基质辅助激光解吸电离；真菌；感染

近年来，随着广谱抗菌药物的广泛应用、器官移植以及导管技术的开展，肿瘤患者和接受免疫抑制剂治疗者逐年增多，真菌感染（如假丝酵母菌属、隐球菌属和曲霉属等）成为危及这类患者健康的主要因素之一。很多真菌生长缓慢，传统的培养鉴定方法所需时间较长，一般为3～10 d，给早期诊断和针对性治疗带来困难，导致真菌感染死亡率升高[1]。目前，多数临床实验室仍采用传统的鉴定方法进行真菌鉴定，但真菌的出现日益多样化，使鉴定真菌病原体难度不断增大，传统鉴定方法已显不足，尤其对不常见的疑难真菌[2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来新兴的菌种鉴定技术，可通过直接检测生物标志物（蛋白）鉴定病毒、细菌、真菌及分枝杆菌[3-6]，具有高敏感性、高通量和快速的特点。为探讨质谱仪在真菌感染诊断中的应用，评价其鉴定真菌的能力，特进行以下实验。

1 材料与方法

1.1 材料从2011年1月—2014年12月分离自我院住院患者的真菌菌株中选取227株酵母样真菌和100株丝状真菌进行实验。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂主要为沙保弱琼脂平板（Oxoid公司，英国）、PDA培养基（Oxoid公司，英国）、需氧培养瓶（北京伯泰生物技术有限公司）、酵母菌鉴定卡（法国生物梅里埃股份有限公司）、棉蓝染色液（珠海贝索生物技术有限公司）、HCCAα-氰基-4-羟基肉桂酸（布鲁克公司，德国）、无水乙醇、乙腈及甲酸（Fisher Scientific，美国）、ITS4（华大基因）、ITS5（华大基因）、Premix Taq Version 2.0（TaKaRa，日本）、玻璃珠法柱式真菌DNAout（北京天恩泽基因科技有限公司）、Regular Agarose G-10（Biowest，西班牙）、50×TAE（北京索莱宝科技有限公司）、90mm平板（江苏康健医疗用品有限公司）、1.5ml离心管（Axygen，美国）、15ml离心管（浙江拱东医疗科技有限公司）和PCR管（Axygen，美国）。

1.2.2 仪器主要有质谱仪Microflex（布鲁克公司，德国）、VITEK-2全自动鉴定仪（法国生物梅里埃股份有限公司）、电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）、霉菌培养箱（宁波江南仪器厂）、高速离心机（Thermo，美国）、PCR仪（BIO-RAD，美国）、电泳仪（BIO-RAD，美国）和凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）。

1.3 培养将菌株接种于沙保弱琼脂平板上，酵母样真菌置于35℃孵箱培养24～48 h，丝状真菌置28℃孵箱培养48 h。

1.4 真菌鉴定

1.4.1 酵母样真菌

1.4.1.1 质谱仪鉴定将1μl菌落加在300μl无菌蒸馏水中悬浮，再加入900μl无水乙醇混匀，将样品高速离心（13 000 r/min）2min，弃去上清液；在沉淀中加入70%甲酸50μl和乙腈50μl充分混匀，将样品再高速离心2min；将1μl上清点在MALDI靶板上，干燥后覆盖1μl基质溶液（饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸、50%乙腈和2.5%三氟酸溶液），在室温下结晶风干，用质谱仪进行鉴定。使用FlexControl3.0软件采集图谱，采用氮基光源及线性阳离子检测模式，加速电压20 kv，延迟提取电压16.80 v，延迟时间为130 ns，激光发射电压2500mv,激光频率为40Hz，每个靶点设激光随机射击100个点，每次射击5次，m/z的采集范围为2～20 kDa[7-8]。用MALDIBiotyper 3.0系统进行数据库比对，得出鉴定结果。每株菌点3个靶点，进行平行检测，取评分最高的点计入数据统计。

1.4.1.2 VITEK-2鉴定用无菌棉签挑取纯培养的酵母样菌落，混悬于0.45%的Nacl溶液中，配成1.8～2.2McF，用酵母菌鉴定卡（YST）按照VITEK-2全自动鉴定仪操作步骤进行鉴定。

1.4.2 丝状真菌

1.4.2.1 质谱仪鉴定用在蒸馏水中浸湿的无菌拭子，刮取培养48 h的丝状真菌菌落，在300μl蒸馏水中悬浮，菌液浑浊后再加入900μl无水乙醇混匀，将样品高速离心2min，弃去上清液，在孵箱中干燥2min；在沉淀中加入70%甲酸100μl和乙腈100μl充分混匀，将样品再高速离心2min。后续操作步骤同1.4.1.1。

1.4.2.2 显微镜检查将丝状真菌点种在PDA培养基上培养3 d，用透明胶带粘取丝状真菌表面，置于滴有棉兰染液的玻片上，在显微镜下观察孢子和分生孢子的形态、生长方式及菌丝特征等进行形态学鉴定[9]。

1.4.3 真菌阳性瓶鉴定初步涂片确定为真菌的胸腹水及引流液标本阳性培养瓶，吸取10ml阳性瓶中液体或丝状真菌的菌团，放入15ml离心管中3500 r/min离心10min，将沉淀转移到1.5ml离心管中，加入1ml蒸馏水，充分混匀后高速离心2min，弃去上清液。沉淀按照上述质谱仪鉴定的方法进行操作。

1.4.4 分子生物学鉴定真菌菌株按照玻璃珠法柱式真菌DNAout试剂盒操作方法提取DNA，选择真菌鉴定通用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）进行扩增[10]。PCR反应体系参照Premix试剂说明书配制。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在凝胶成像系统上观察是否有条带。目的片段进行双向测序，将测序拼接结果利用BLAST进行比对，确定鉴定结果。

1.5 统计学处理用Excel2003软件建立数据库，用描述性统计学方法进行分析，计算相应的发生率。

2 结果

2.1 酵母样真菌227株酵母样真菌质谱鉴定结果为：白假丝酵母菌70株，克柔假丝酵母菌32株，热带假丝酵母菌35株，光滑假丝酵母菌46株，近平滑假丝酵母菌10株，季也蒙假丝酵母菌6株，角膜假丝酵母菌4株，葡萄牙假丝酵母菌9株，新型隐球菌6株，似平滑假丝酵母菌2株，拟平滑假丝酵母菌1株，乳酒假丝酵母菌2株，挪威假丝酵母菌1株，阿萨希毛孢子菌1株，未出结果2株，其中鉴定错误1株。质谱仪鉴定结果与VITEK-2鉴定结果比对，发现有21株有差异，经分子生物学方法确定20株与质谱结果相同，1株与VITEK-2结果相同。质谱未出结果的菌中1株为皱褶假丝酵母菌，1株为季也蒙假丝酵母菌，将1株奥默柯达菌错误鉴定为季也蒙假丝酵母菌。总体鉴定率为98.68%（224/227）。质谱未鉴定出的1株季也蒙假丝酵母菌，VITEK-2鉴定正确，其鉴定率为90.31%（205/ 227）。质谱鉴定正确率高于VITEK-2。质谱与VITEK-2的鉴定结果比对见表1。

根据质谱说明书判断结果，标准为评分＞2.0在种水平可信，1.7～2.0在属水平可信。226株酵母样真菌（不包含鉴定错误的1株菌）的质谱评分结果见表2，达到种水平的鉴定率为90.31%（205/ 227），达到属水平为98.68%（224/227）。

表1 酵母样真菌鉴定结果比对（株）Table 1 Comparison of the results of the identification of yeast-like fungi(strains)

表2 酵母样真菌的质谱鉴定评分结果（株）Table 2 Scores of the identification of yeast-like fungi by mass spectrometry(strains)

2.2 丝状真菌质谱鉴定临床分离的丝状真菌共100株，鉴定结果为烟曲霉菌70株，黄曲霉菌15株，黑曲霉菌5株，白地霉菌1株，茄病镰刀菌1株，米曲霉菌2株，青霉菌3株，未出结果3株，分别为总状毛霉菌、粗糙脉孢菌和棘孢木霉。经传统方法鉴定和分子生物学方法验证后，有3株鉴定错误，鉴定率为94.00%（94/100），曲霉菌的鉴定正确率为96.74%（89/92）。见表3。

质谱鉴定结果评分＞2.0的为74株，1.7～2.0为20株，达到种水平的鉴定率为74.00%（74/100），达到属水平为94.00%（94/100）。97株丝状真菌（不包含鉴定错误的3株菌）的质谱评分结果见表4。

表3 丝状真菌鉴定结果比对（株）Table 3 Comparison of the results of the identification of filamentous fungi(strains)

表4 丝状真菌质谱评分结果（株）Table 4 Scores of the identification of filamentous fungi by mass spectrometry(strains)

2.3 真菌质谱图谱不同真菌图谱中的特异峰不同（图1）。

图1 部分酵母样真菌质谱图Figure 1 M ass spectrum of yeast-like fungi

2.4 真菌阳性培养瓶的鉴定本实验从初步涂片确定为真菌的阳性培养瓶中直接提取菌种蛋白，用质谱仪进行鉴定。实验8例，除1例为混合感染未提取到有效菌种蛋白鉴定失败，其余7例均与培养后鉴定结果一致，菌种类别分别为白假丝酵母菌4株，黄曲霉菌1株，近平滑假丝酵母菌1株，光滑假丝酵母菌1株。

2.5 鉴定用时质谱仪可在菌种鉴定当日得出结果，平均用时20min；VITEK-2鉴定酵母样真菌需要24～48 h，丝状真菌鉴定需要在PDA培养基上培养3 d才能在镜下看到理想的形态；分子生物学方法需经过测序得到鉴定结果，也要经过24～48 h。所以质谱仪是目前真菌鉴定方法中用时最短，操作也相对简便的方法。

3 讨论

真菌感染已成为临床抗感染治疗的棘手问题，早期、快速、准确的诊断是及时救治的关键[11]。全球每年约有7280万例假丝酵母菌感染；在美国，假丝酵母菌感染是院内血流感染致死的重要因素，其中白假丝酵母菌成为最重要的致病真菌[2]。目前，临床常用的酵母样真菌鉴定方法有科玛嘉显色培养法、VITEK-2和API AUX鉴定法，对常见酵母样真菌（白假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌）的鉴定正确率可达到92%～96%[12]，但对某些酵母样真菌鉴定准确度低，如不能准确鉴定格特隐球菌[13]。鉴定丝状真菌常采用PDA培养后，显微镜镜下观察形态特点和产孢方式，并结合菌落生长形态和颜色等，要求检验人员有丰富的丝状真菌鉴定经验，易产生人为误差，且操作时对环境易造成污染。分子生物学方法是目前公认的“金标准”[9]，但其操作步骤繁琐，单株菌的前处理需1 h，鉴定需24～48 h，对操作人员的要求高，易受到污染导致鉴定失败。

质谱技术是近年研究的热点，以高通量、快速、准确等优点受到微生物实验室的关注。不同菌的蛋白表达不同，通过质谱仪得到的蛋白质图谱也不同，将待测菌的蛋白图谱和数据库进行比对，根据图谱的匹配度，得出鉴定结果和相应的鉴定分值，分值越高匹配度越好，结果越可信。本研究用质谱仪对临床分离的14个种的227株酵母真菌进行鉴定，按照质谱评分标准，鉴定分值达到种水平（评分＞2.0）的为90.31%（205/227），达到属水平（评分＞1.7）为98.68%（224/227），与国内外报道基本一致[2，14-15]。丝状真菌鉴定评分达到种水平的为74.00%（74/100），达到属水平为94.00%（94/100）。由此可见，质谱仪在鉴定酵母菌上优势更突出。经过与传统鉴定方法的结果比对以及分子生物学方法对结果的确认，我们发现质谱鉴定评分＞1.7的结果，作为临床真菌种水平的诊断准确性也较高，在今后的研究中将继续评价。目前质谱MALDIBiotyper 3.0系统中有178种酵母样真菌的图谱，但仍缺少个别种类，如本研究中鉴定错误的奥默柯达菌。国外有研究生物梅里埃的Vitek MS系统，对奥默柯达菌的鉴定正确率为90.9%[16]，可见质谱数据库的完善程度直接影响其鉴定能力。有文献统计质谱仪对以下丝状真菌鉴定效果较好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癣菌、镰刀菌、木霉和毛霉目[12]，特别是临床常见的曲霉菌。本研究中曲霉菌的鉴定正确率达到96.74%（89/ 92），与国外报道相似[6]，可替代临床实验室曲霉菌的传统鉴定方法。丝状真菌的数据库图谱较少，这为实验室提供了更大的拓展空间，实验室可根据自己的特点，建立个性化的数据库，提高检测效率和准确性。

随着真菌研究的深入，发现真菌表型分类存在局限性，应用分子生物学技术从遗传和进化角度进行分类是目前真菌分类的方向[4]。例如近平滑假丝酵母菌通过基因分型可分为近平滑假丝酵母菌、似平滑假丝酵母菌和拟平滑假丝酵母菌3组，而且三者之间对药物的敏感性存在差异，特别是棘白菌素抗真菌药[17-18]。这表明物种鉴定可能对治疗产生影响。本研究中对2株似平滑假丝酵母菌和1株拟平滑假丝酵母菌，质谱仪都进行了准确的鉴定，而VITEK-2未鉴定出结果。Quiles-Melero等[19]对77株临床分离的近平滑假丝酵母菌复合群进行了质谱分型，并用分子生物学方法进行了验证，符合率为100%，提示通过质谱仪可以对近平滑假丝酵母菌复合群进行准确的种内分型，以便更好地指导临床用药。

本研究通过对现有各种真菌鉴定方法用时的比较，发现质谱仪单株真菌鉴定用时仅需20min，并且可同时检测多株菌，是目前用时最短、操作也较简便的方法，实验室人员经过培训都可独立操作，人为误差较小。布鲁克公司虽然已有检测阳性血培养的成品试剂盒Bruker Sepsistyper问世，但价格较高，标本只局限于血培养。国外有报道称不能直接从体液中直接检测真菌，必须通过前期的分离培养[20]。本研究初步发现，培养瓶中真菌只要为单一种类，质谱鉴定可以得到满意的结果。此方法可将体液真菌感染的鉴定时间提前24 h，为临床治疗争取了时间。

质谱仪在鉴定真菌的种属水平上都达到了满意的结果，尤其鉴定酵母样菌和曲霉菌的能力更为突出，大大缩短临床微生物鉴定的时间，且满足真菌检测的需求，可作为实验室检测真菌的常规方法。

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（2015-05-15收稿 2015-06-23修回）

（责任编委 辛绍杰 本文编辑 陈玉琪）

Application and evaluation ofmass spectrometry in identification of fungal infection

WANG Huan,JIA Tian-ye,BAO Chun-mei,ZHANG Cheng-long,ZHANG Ju-Ling,CUIEn-bo, CHEN Su-ming,XU dong-ping*,QU Fen*
Postgraduate Squad,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100036,China
*Corresponding author.XU dong-ping,E-mail:xudongping302@sina.com;QU Fen,E-mail:qf302@163.com

Objective To investigate the application ofmass spectrometry to the fungal infection,and to evaluate its ability to identify fungal infection.M ethods Totally 327 strains of fungi isolated from the inpatients admitted to our hospitalwere selected,and identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry(MALDI-TOFMS).The resultswere then compared with those of the identification by VITEK-2(yeast-like fungi)andmicroscope(filamentous fungi).Molecular biologymethods were used to confirm the identification.Results The results of the identification by MALDI-TOFMSshowed that identification rate of yeast-like fungiatspecies level(score>2.0)was90.31%,and thatat the genus level(score>1.7)was98.68%;identification rate of filamentous fungiatspecies levelwas 74.00%,and thatat the genus levelwas 94.00%.The accuracy of identification of Aspergillus could reach 96.74%.Conclusions Fungalspecies can bewell identified byMALDI-TOFMS,especially yeastsand Aspergillus.The identification by MALDI-TOFMScan be used as routine detectionmethod for clinical laboratory.

spectrometry,mass,matrix-assisted laserdesorption-ionization;fungi;infection

R379

A

1007-8134(2015)04-0210-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.04.006

首都卫生发展科研专项基金（2011-4001-9）

100036北京，军事医学科学院研究生队（王欢）；100039北京，解放军第三〇二医院临床检验医学中心（王欢、贾天野、鲍春梅、张成龙、张鞠玲、崔恩博、陈素明、曲芬），肝衰竭诊疗与研究中心（徐东平）

徐东平，E-mail:xudongping302@sina.com；曲芬，E-mail: qf302@163.com