结核分枝杆菌临床株对利福霉素类药物的耐药特点分析

杨栗坤，孙雯娜，王心静，王仲元，程小星

结核分枝杆菌临床株对利福霉素类药物的耐药特点分析

杨栗坤，孙雯娜，王心静，王仲元，程小星

目的比较分析临床标本结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）对利福霉素类药物的耐药特点，为含利福霉素类药物的抗结核治疗方案的改进提供细菌学基础。方法用绝对浓度法检测470份临床标本中Mtb的耐药情况。结果180份培养阳性的标本中，41份对利福霉素类耐药，对利福平和利福喷汀的耐药水平高度一致，对二者的耐药水平显著高于对利福布汀的耐药水平，对低浓度和高浓度利福布汀耐药的数量差异显著。结论临床标本中的Mtb对利福平和利福喷汀的耐药水平表现出高度一致性，提示利福喷汀不适于作为利福平耐药的后备药物，利福布汀可以作为利福平的后备药物，但服用剂量可能影响治疗效果。

结核分枝杆菌；利福霉素类；抗药性；治疗学

利福霉素类药物对细胞内、细胞外、任何生长环境和生长状态的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）均有杀菌作用，是完全杀菌药，毒性低，不良反应小，在结核病的药物治疗中仍具有无可替代的地位，我国将利福平、利福喷汀和利福布汀全部归为一线口服药[1]。目前结核病治疗上，对利福平、利福喷汀和利福布汀的使用较大程度上凭借经验，本研究比较临床标本中Mtb对3种利福霉素类药物的耐药分布，以期为其应用提供细菌学证据。

1 材料与方法

1.1 菌株、标本及培养基H37Rv标准株由解放军第三〇九医院结核重点实验室提供。临床标本系2014年8—12月实验室接收的临床检测标本。Mtb药物敏感性（药敏）罗氏培养基（绝对浓度法）购自珠海银科医学工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备用10%Tween-80水溶液将传代后培养2～3周的新鲜培养物配置成1mg/ml的菌悬液，用0.9%氯化钠溶液稀释至0.01mg/ml。

1.2.2 接种分别接种0.1ml如上菌液至无药对照和各含药培养基斜面上，每管接种菌量为0.001mg。

1.2.3 观察和报告结果接种后第28天检查无药对照和含药培养基，记录菌落生长情况。在无药对照培养基上菌落生长旺盛的前提下，含药培养基上生长的菌落数多于20个，判定为耐药[2]。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0软件对检测指标进行统计分析。不同组间耐药程度的比较采用秩和检验，2组率的比较采用四表格χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床标本来源及检测结果检测临床标本470份，培养Mtb阳性180份，其中2份标本（1份痰标本和1份支气管肺泡灌洗液标本）来自同一例患者，耐利福霉素类药物的标本共41份，耐药标本均来自肺结核患者，其中1份胸腔积液标本的患者伴发支气管胸膜瘘。标本性状和检测结果见表1。

表1 标本来源及检测结果(份)Table 1 Clinical isolate types and numbers of positiveculture of M tb and rifamycin-resistant isolates(samp les)

2.2 耐3种利福霉素类药物分布情况定义菌落生长占斜面面积1/4为A，菌落生长占斜面面积1/2为B，菌落生长占斜面面积3/4为C，全斜面生长、菌落融合为D（用生长面积大小表示耐药程度的大小，耐药程度按A、B、C、D依次增强）。每种药物分为高低2个浓度，41份标本表现为对低浓度和高浓度药物同时耐药，或仅对低浓度药物耐药。其中1份标本对利福喷汀耐药，但对利福平敏感，其余40份标本对高、低浓度的利福平和利福喷汀的耐药水平差异无统计学意义。对高、低浓度利福布汀的耐药水平均显著低于对利福平和利福喷汀的耐药水平（P均＜0.01），对低浓度和高浓度利福布汀耐药数量差异有统计学意义（χ2=8.765,P=0.003）。对3种利福霉素类药物的耐药水平分布见表2和表3。

表2 M tb对3种低浓度利福霉素类药物的耐药情况(份)Table 2 Distribution of drug resistance levels of M tb to 3 kinds of rifam ycins at low concentration(samples)

注：Kruskal-Wallis秩和检验，H c=25.488，P=0.000。两两比较，利福喷汀组vs利福平组，P＞0.05；利福布汀组vs利福平组，P＜0.01；利福布汀组vs利福喷汀组，P＜0.01

3 讨论

结核病在世界范围内是第二大致死性传染病[3]，2013年中国大陆报告结核病发病数为904 434例，居当年传染病发病数的第二位[4]。

根据药物的杀菌活性、临床疗效和安全性，抗结核药物被分为一线和二线药物。WHO在原有分类的基础上将抗结核药物分为5组，我国在WHO分组的基础上将口服一线药物（第1组）增加了利福喷汀，因此，目前利福平、利福喷汀和利福布汀全部为一线抗结核药物[1]。利福霉素类药物在初治结核病和复治结核病中均发挥重要作用[5]。

表3 M tb对3种高浓度利福霉素类药物的耐药情况(份)Table 3 Distribution of drug resistance levels of M tb to 3 kinds of rifam ycins at high concentration(sam ples)

利福霉素及其衍生物的作用机制是通过与细菌RNA聚合酶β亚基结合，抑制转录开始，从而发挥杀菌作用[6]。利福喷汀是利福霉素C-3位腙类衍生物，抗菌谱与利福平相同，但利福喷汀的抗结核活性比利福平强2～10倍，具有比利福平更强的杀菌效力，且对Mtb的延缓生长期明显长于利福平，是利福平的1.56～1.70倍，间歇治疗活性高[6-7]。有研究发现对利福平耐药的Mtb，仍有部分对利福喷汀具有一定的敏感性，因此认为对利福平低耐药的结核病患者给予利福喷汀可能有效，对利福平高耐药的结核病患者则可能无效[8]。基于利福喷汀的药效特点和实验研究，目前在临床上，当包含利福平的治疗方案失败时，利福平常常被更换为利福喷汀。有作者认为当出现对利福平耐药时可选用利福喷汀或利福布汀，但对后者耐药时则不可选用前者。但是，在本研究的41例耐利福霉素的患者中，27例按医嘱服药，初治失败后，利福平被更换为利福喷汀，治疗效果不佳，研究结果发现对利福平耐药的临床标本，全部对利福喷汀耐药，且耐药程度呈现高度的一致性，而且其中1份对利福喷汀耐药，但对利福平敏感。由于利福喷汀的高效和长效性，有益于提高患者的依从性，有研究比较了利福喷汀和利福平作为初治一线药物的临床应用，结果显示利福喷汀的治疗效果与利福平无显著差异或优于利福平，而且不良反应少[9-10]。这些研究结果提示，临床上利福喷汀不适宜作为利福平的后备药物使用，但可能代替利福平成为初治方案的一线药物。

利福布汀是螺哌啶利福霉素类衍生物，体外抗菌活性是利福平的2～4倍，但对肝微粒体酶的影响比利福平小，在组织细胞内容易吸收[11]。利福布与利福平存在交叉耐药性，但不同作者报道的二者交叉耐药率结果有所差异，多为70%～80%。有研究发现对低浓度利福平耐药时更易于对利福布汀敏感，而当对高浓度利福平耐药时，会出现对两药的完全交叉耐药[12]。本研究的结果是对低浓度利福布汀和利福平的交叉耐药率为82.5%，对高浓度利福布汀和利福平的交叉耐药率为57.6%。对高浓度利福平耐药的33份标本中，1份对利福布汀敏感，32份标本对低浓度利福布汀全部耐药，但耐药水平显著低于对利福平的耐药水平，其中仅19份对高浓度利福布汀耐药。相关的临床研究表明，作为耐多药结核病联合化疗的药物之一，利福布汀在痰菌阴转方面优于利福喷汀[13]，本研究结果从细菌学角度支持了这个临床研究结论。

90%～95%对利福平耐药菌株的rpoB基因存在突变，因此rpoB基因突变分析已经作为利福平的快速药敏检测方法，但有研究发现rpoB基因某些位点的突变可能仅与对利福平耐药有关，而不引起对利福布汀耐药，而且23.9%对利福布汀敏感菌株存在rpoB基因突变[11]。因此Mtb对利福霉素的耐药机制尚须进一步研究。

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（2015-03-10收稿2015-06-09修回）

（责任编委曲芬本文编辑王姝）

Characteristics of resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifam ycins in clinical isolates

YANG Li-kun,SUNWen-na,WANG Xin-jing*,WANG Zhong-yuan,CHENG Xiao-xing
Institute of Tuberculosis,309 Hospital of PLA,Beijing 100091,China
*Corresponding author,E-mail:xinjing15@163.com

Objective To provide the bacteriologicalbasis for improving the use of rifamycinsby analyzing the characteristics of resistance of clinically isolated Mycobacterium tuberculosis(Mtb)to rifamycins.M ethods Absolute concentration method was performed to detect resistance of Mtb in 470 clinical isolates.Results Of 180 samples positive for Mtb,41 were resistant to rifamycins. The resistance levels ofMtb in clinical isolates to rifampicin and rifapentine were highly consistent,and they were significantly higher than that to rifabutin.The numbers of sampleswith resistance ofMtb to rifabutin ata low concentration were significantly different from those to rifabutin ata high concentration.Conclusions The result that the resistance ofMtb to rifampicin ishighly consistentwith that to rifapentine suggests that rifapentine should not be suitable to replace rifampicin after Mtb is resistant to rifampicin;rifabutin should be able to replace rifampicin,but the dose of rifabutinmay affect the therapeutic efficacy.

Mycobacterium tuberculosis;rifamycins;drug resistence;therapeutics

R378.911

A

1007-8134(2015)04-0215-03

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.04.007

国家自然科学基金面上项目（81071319）；国家“十二五”科技重大专项（2013ZX10003006-003）

100091北京，解放军第三〇九医院结核病研究所（杨栗坤、孙雯娜，王心静、王仲元、程小星）

王心静，E-mail:xinjing15@163.com