不同剂量嗅鞘细胞静脉移植修复脊髓损伤的实验研究

王 强 于 霞 魏开斌 李 军 刘雨亮 张文正

(泰山医学院附属泰山医院，1.脊柱关节外科;2.核医学科，山东泰安271000)

不同剂量嗅鞘细胞静脉移植修复脊髓损伤的实验研究

王 强1于 霞2魏开斌1李 军1刘雨亮1张文正1

(泰山医学院附属泰山医院，1.脊柱关节外科;2.核医学科，山东泰安271000)

目的研究和探讨嗅鞘细胞静脉移植修复脊髓损伤的疗效与移植剂量的关系，探求较佳的静脉移植剂量。方法制备Wistar大鼠T10脊髓左侧半切模型，随机分成五组:嗅鞘细胞大剂量移植组(A组)、嗅鞘细胞中剂量移植组(B组)、嗅鞘细胞小剂量移植组(C组)、培养液D/F12移植组(D组)、空白对照组(E组)。定期行大鼠神经功能评价及组织形态学观察，评价脊髓恢复情况。结果A、B组神经功能恢复和组织学改变与C、D、E组有显著差别(P＜0.05);C组与D、E组间虽有差别(P＜0.05)，但是其差别较小;A、B组之间无显著差别(P＞0.05);D、E两组无显著差别(P＞0.05)。结论嗅鞘细胞静脉移植对修复脊髓损伤有一定的疗效，其疗效与移植剂量在一定范围内存在正向关系。细胞移植的较佳剂量为2×106，低于此剂量则不能达到良好的疗效，多于此剂量，疗效无明显提高。此种移植方式既使操作简单容易，又具有较好的疗效，并且可以重复多次进行，具有良好的临床推广和应用价值。

嗅鞘细胞;脊髓损伤;静脉移植;不同剂量;疗效

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种临床上常见的高致残性疾病，同时也是临床疑难病之一，其治疗困难，方法不一，研究［1－6］发现，嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植能够促进脊髓损伤后神经修复和轴突再生，被认为是治疗脊髓损伤最有前景的细胞之一。研究证实嗅鞘细胞静脉移植对治疗急性脊髓损伤有一定的疗效，本实验通过不同剂量嗅鞘细胞静脉移植，研究大鼠急性脊髓损伤修复疗效与嗅鞘细胞静脉移植剂量的关系，探求最佳静脉移植剂量。

1 材料与方法

1.1 实验动物3月龄健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，清洁级，体重200～250 g。

1.2 嗅鞘细胞的培养、纯化以及鉴定应用改良Nash差速贴壁法和Ara-c抑制法相结合的方法进行OECs的培养、纯化及鉴定。用终浓度为10 μg/ml的双苯亚甲胺进行OECs细胞核染色标记，收集细胞计数，调整细胞浓度为1×106/ml、1×107/ml、1× 108/ml备移植用。

1.3 动物模型的制备以及分组制备T10脊髓左侧半切模型。随机分成5组:嗅鞘细胞大剂量静脉移植组(A组)、嗅鞘细胞中剂量静脉移植组(B组)、嗅鞘细胞小剂量静脉移植组(C组)、培养液D/F12静脉移植组(D组)、空白对照组(E组)，每组各10只。A组:微量注射器经尾静脉缓慢推入200 μl嗅鞘细胞悬液(细胞量约为2×107)，立即冲管注入生理盐水0.1 ml，压迫止血1分钟;B组:同A组方法推入200 μl嗅鞘细胞悬液(细胞量约2× 106);C组:同A组方法推入200 μl嗅鞘细胞悬液(细胞量约2×105);D组:同A组方法推入200 μl细胞培养液D/F12;E组:不做任何移植，只做模型处理。

术后护理:保持室温在20～25℃，并保持通风，保持笼具卫生清洁干燥，每只大鼠单笼喂养;术后肌注青霉素5天，手术刀口每天换药2次，预防感染;每天挤压膀胱排尿2次，直到膀胱功能恢复;每天定时翻身2～3次，预防褥疮发生。

1.4 观察指标

1.4.1 分别于术后第1d、1w、2w、3w、4w、6w、8w、10w，根据改良CBS评分法对每组大鼠进行后肢运动、感觉功能评分，评估脊髓功能恢复情况。运动、感觉功能从完全丧失到正常用0～100分表示:100分－完全丧失，0分－正常。

1.4.2 组织形态学观察移植术后4、10周，分别于各组随机抽取大鼠进行脊髓组织的取材、切片。以T10为中心，完整取出长约2 cm的脊髓组织，观察其大体特征(连续性、瘢痕增生、与周围组织的粘连程度等)。立即行冰冻纵轴切片，片厚5 μm，在荧光显微镜下观察OECs存活情况。石蜡切片进行HE染色、嗜银染色，观察脊髓损伤区域瘢痕增生以及神经纤维再生情况，神经生长因子受体(NGFR p75)免疫组化染色检测OECs在SCI区域的存活、分布等。

1.5 统计学分析采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量数据以¯x±s表示，组间比较采用方差分析，不同周次间数据的比较采用重复测量数据的方差分析，相对数的比较采用χ2检验。P≤0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 移植术后不同时段CBS评分结果移植术后1d、1w各组评分结果没有明显差异(P＞0.05);从第2周开始到第8周，A组、B组和D组、E组、C组差异有统计学意义(P＜0.05)。C组与D、E组之间差异有统计学意义(P＜0.05);A、B两组之间差异没有统计学意义(P＞0.05);D、E两组之间差异没有统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 术后各组大鼠CBS评分分析结果(n=10)

2.2 大体标本观察第4周时，脊髓组织损伤处硬脊膜完整，由不透明的白色组织覆盖，脊髓组织水肿，但不很严重，有瘢痕形成，无明显炎性反应，与椎管内周围组织粘连较重，需锐性剥离，损伤处较脊髓正常部位稍粗;第10周时，损伤处硬脊膜完整，仍然可以看到损伤处由不透明的白色组织覆盖，脊髓组织无明显水肿及明显炎性反应，有瘢痕形成，但瘢痕挛缩软化，与椎管内周围组织粘连较轻，相对容易剥离，脊髓组织损伤部位较脊髓正常组织部位变细。

2.3 组织学观察

2.3.1 HE染色第4周时，损伤部位有多量胶质细胞增生，形成瘢痕组织，局部有囊腔形成，可以见到少量轴突再生，再生的轴突纤维方向不一致，结构相对杂乱。A、B组较D、E组可见较多量的再生轴突，组织修复较好，D、E组仅见到少量零乱的轴突; C组修复优于D、E两组，但较A、B两组差;10周时，各组都有组织修复，A、B组可见到轴突再生数量增多，明显多于D组、E组，且轴突明显较4周时增粗，脊髓断端以远轴突逐渐变细，相对变直，沿脊髓纵轴向远端生长，排列相对较一致，有新生轴突能够跨过损伤区域与远端桥接，并且瘢痕组织少于E组、D组;D、E组仅见到少量零乱的轴突，C组修复较D、E两组好，但是较A、B两组差;而D、E组修复较A、B组差，仍有大量瘢痕组织，极少量轴突再生，但排列较紊乱，方向性差，尚未跨越过损伤区。

2.3.2 嗜银染色第4周时，A、B组可见少量再生的神经纤维轴突，并且新生轴突迂曲，较杂乱，没有一致的方向性，再生的纤维数量较D、E、C组多，D、E、C组中可以看到更少量零乱的神经纤维轴突，方向更加杂乱无章;10周时，A、B组可以看到较多量的神经纤维轴突再生，并且迂曲减轻，方向性相对较一致，大体均向损伤部位沿着脊髓纵轴方向生长，有部分轴突能够通过脊髓损伤部位与远端形成桥接(图1，2)，而E、D组明显差于A组和B组，仅有极少量纤维增生，并且轴突不能够通过脊髓损伤部位。

图1 B组4周轴突再生银染×200

图2 A组10周轴突再生银染×200

2.3.3 双苯亚甲胺Hoechst荧光检测分别于4w、10w取脊髓组织做快速冰冻切片，观察发现:4周时在细胞移植组可见到标记的嗅鞘细胞，发出淡蓝色荧光，聚集在脊髓损伤部位，远离损伤部位的正常脊髓组织没有蓝色荧光出现。A、B两组蓝色荧光数量较C组多，说明移植后的嗅鞘细胞向脊髓损伤部位聚集，4周后仍能够存活。第10周时冰冻切片荧光显微镜下未检测到荧光，说明嗅鞘细胞可能已经死亡。D、E组未检测到蓝色荧光。

2.3.4 NGFR p75免疫组化染色观察A、B、C组在细胞移植后4周可见到多量的阳性染色(棕黄色)区域(图3)，距离损伤部位越近的区域较明显，并且随着距离的增大阳性染色逐渐减弱，而损伤区域以远的正常脊髓组织未见阳性染色，说明嗅鞘细胞能够迁移到脊髓损伤部位，并且4周后能够在脊髓损伤部位存活，分布于脊髓损伤部位。移植术后10周时候未看到阳性染色;而D、E组在4周和10周时均未观察到有阳性染色。

图3 B组4周p75阳性染色(棕黄色)×100

3 讨论

脊髓损伤多是由于脊柱的稳定性遭到破坏引起，受到损伤的脊髓组织会出现水肿，循环障碍，血液供应减少，引起一系列的级联反应，形成恶性循环［7－8］。神经损伤后难以再生，从而导致神经功能的完全或者部分丧失，往往会造成瘫痪等严重的后果，其修复在以往被认为是难以攻破的。

本实验发现:嗅鞘细胞静脉移植能够促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复。从CBS评分可以看出，移植术后2周A、B组CBS评分明显低于C、D、E组，有显著性差异(P＜0.05)，C组评分稍低于D、E组，虽有差异(P＜0.05)，但是其均数差异较小，这说明A、B组对大鼠的神经功能恢复有较好的疗效，C组虽有疗效，但是疗效较A、B差。本实验证实了OECs静脉移植治疗SCI的疗效，并对其修复机制进行了一定的探讨，其可能是通过以下机制发挥作用:①脊髓损伤后，损伤部位的血-脊髓屏障遭到破坏，局部毛细血管的通透性增加，静脉移植的嗅鞘细胞进入损伤部位并生长繁殖发挥作用;②脊髓损伤后局部各种细胞因子以及趋化因子增多，血液中的嗅鞘细胞受到趋化作用向脊髓损伤部位迁移;③脊髓损伤后引起一系列炎症反应，多种炎症因子以及免疫分子增多，如TNF-α、IL-1β等，嗅鞘细胞有一定的免疫原性同时表达粘附分子，有利于嗅鞘细胞向损伤部位迁移聚集;④脊髓损伤后，局部微循环遭到破坏，血流速度减慢，为嗅鞘细胞进入脊髓损伤部位提供了条件;⑤到达损伤部位的嗅鞘细胞能够抑制星形胶质细胞增生及活化，并能够诱导其分泌脑源性以及胶质源性神经生长因子，改善局部微循环，减轻局部炎性反应，促进神经纤维轴突再生;⑥嗅鞘细胞独特的成鞘作用能够促进轴突生长、延伸并且包裹轴突，使新生轴突重新髓鞘化，保护新生轴突与外界胶质环境相隔绝，为其生长提供良好的微环境，同时帮助神经纤维轴突穿过胶质瘢痕形成神经胶质桥［9］，促进神经功能恢复;⑦刺激其它保护和修复机制。

嗅鞘细胞移植后在脊髓损伤部位存活时间的长短关系到脊髓损伤后修复的疗效，就是其存活时间的研究到目前为止没有得出一致的结论:陈莉发等［10］研究发现，将6×105个嗅鞘细胞移植到脊髓损伤后的T10节段处，检测发现移植的嗅鞘细胞能够存活4周以上，但是小于8周;也有研究发现，移植的嗅鞘细胞可在宿主体内长期存活，最长能够存活7个月。本实验将经双苯亚甲胺(Hoechest)标记的嗅鞘细胞通过静脉移植到脊髓损伤的大鼠体内，4周后在荧光显微镜下检测到有淡蓝色的发光颗粒(双苯亚甲胺标记的嗅鞘细胞核)，通过NGFR p75 (嗅鞘细胞的特异性抗体)免疫组织化学染色检测发现阳性黄染区域，表明有嗅鞘细胞存活。10周时，镜下未检测到蓝色荧光颗粒，NGFR p75免疫组化染色也未发现阳性染色，说明移植的嗅鞘细胞可能已经死亡。这与陈莉发的实验研究结论相似。嗅鞘细胞通过不同移植方式治疗脊髓损伤均取得了一定的疗效。任继鑫等将2.5×105个嗅鞘细胞局部移植注射到脊髓挫伤加横断的部位，发现具有明显的促进神经纤维再生和功能恢复的作用;魏开斌等［11］将3.5×105个嗅鞘细胞悬液以及嗅球组织块局部移植到大鼠脊髓半切损伤模型脊髓损伤部位，两周后大鼠后肢功能开始恢复，10周时组织学观察，再生轴突方向基本上与正常神经纤维较一致，且有大量的再生轴突跨过损伤区域，大鼠的神经功能均有明显的恢复。本实验通过2×105、2×106、2× 107不同剂量嗅鞘细胞静脉移植治疗急性脊髓损伤，观察和分析发现:细胞移植组对脊髓损伤修复均有一定的疗效，以A、B组明显，但A、B组之间无差异(P＞0.05)，C组疗效较A、B组差，从第2周开始，A、B组CBS评分明显低于其它组，与C、D、E组存在显著差异(P＜0.05)。组织学观察发现，A、B组脊髓组损伤部位再生神经纤维轴突明显增多，这与CBS评分结果相一致。嗅鞘细胞中剂量与大剂量移植有较明显的疗效，小剂量组疗效不是很明显，说明静脉移植嗅鞘细胞只有达到一定的剂量才能够获得较好的疗效，嗅鞘细胞的移植剂量不足则疗效不佳，D、E组无显著差异，说明培养液对脊髓损伤无治疗作用，进一步证实了OECs的修复作用。

本实验可以说明，嗅鞘细胞静脉移植治疗急性脊髓损伤能够促进受损神经轴突再生，促进大鼠后肢功能恢复。嗅鞘细胞静脉移植的较佳剂量是2× 106，只有移植细胞量达到此数值，脊髓损伤恢复才有较好的疗效，低于此剂量则不能取得良好的疗效，剂量再大未发现大鼠神经功能恢复有大的提高。A组移植剂量是B组的10倍，其疗效相似，没有显著差异;而C组剂量是B组的1/10，其疗效明显差，与B组差异有统计学。临床上OECs来源较少，细胞珍贵，就移植OECs剂量与获得良好疗效而言，2× 106是较佳的剂量，既能够达到较好的疗效，又不造成细胞的浪费。嗅鞘细胞静脉移植对急性脊髓损伤虽然有一定的疗效，但不能使其完全恢复，能否多次重复移植，以及重复多次移植的疗效如何等，这些问题还有待于进一步研究证实。

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Repair of rat spinal cord injury by vein transplantation of different doses of Olfactory Ensheathing cells

WANG Qiang1YU Xia2WEI Kai-bin1LI Jun1LIU Yu-liang1ZHANG Wen-zheng1
(1.Dept.of Orthopaedics，Central Hospital of Taian;2.Dept.of Nuclear Medicine，Central Hospital of Taian，Taian 271000，China)

Objective:To compare the efficacy of different doses of olfactory ensheathing cells vein transplantation for treatment of acute spinal cord injury，and the correlation between dose and efficacy.Methods:The Wistar rat model was prepared by the left T10 spinal cord hemisection.The rats were randomly divided into five groups:high-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group A)，intermediate-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group B)，low-dose of olfactory ensheathing cells vein transplantation group(group C)，the culture medium D/F12 vein transplantation group(group D)，the blank control group(group E).The spinal cord restoration was evaluated by the neurological function with a modified CBS score system and histological examination.Results:There was significant difference between group A/B and group C/D/E for the neurological recovery and histological changes(P＜0.05);There was difference between C and D/E，but it was little.There was no significant difference between group D and group E(P＞0.05);with no difference between group A and group B(P＞0.05).Conclusion:The transplantation of olfactory ensheathing cells by vein has a certain effect on treating SCI，and there is a certain positive relationship between the efficacy and transplant dose.The appropriate dose is 2×106，a less dose can not achieve a good effect，and there is no significant improvement with higher dose.This method is simply and easily-operated and it has a good perspective for clinical practice and application.

olfactory ensheathing cells;spinal cord injury;vein transplantation;different doses;efficacy

R826.64

A

1004-7115(2015)05-0494-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.004

2015-01-06)

王强(1981－)，男，山东莱芜人，主要从事脊柱及脊髓损伤诊治工作。

魏开斌，E-mail:wkb1966@163.com。