维生素D受体基因FokI多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究

侯丽君 黄东辉 韩静静

(泰山医学院附属医院内分泌科，山东泰安271000)

维生素D受体基因FokI多态性与糖尿病视网膜病变的相关性研究

侯丽君 黄东辉 韩静静

(泰山医学院附属医院内分泌科，山东泰安271000)

目的探讨维生素D受体(VDR)基因FokI多态性与糖尿病视网膜病变(DR)的关系。方法按1999年WHO糖尿病(DM)诊断及分型标准，选取无亲缘关系的汉族2型糖尿病患者254例，分为单纯2型糖尿病(DM)组、非增殖性视网膜病变(NPDR)组、增殖性视网膜病变(PDR)组，选取健康人群120例为对照组(NC)。采用PCR-RFLP方法确定受试者的VDR基因FokI基因型，对不同组间的临床与生化指标及VDR基因FokI多态性进行统计分析。结果NPDR组和PDR组的ff基因型频率显著高于DM组(χ2=7.49，4.448，P＜0.05)，NPDR组和PDR组的f等位基因频率显著高于DM组(χ2=8.333，5.227，P＜0.05);NPDR组和PDR组的ff基因型频率显著高于NC组(χ2=9.934，4.899，P＜0.05);，NPDR组和PDR组的f等位基因频率显著高于NC组(χ2=10.895，5.714，P＜0.05)，而NPDR和PDR组(Ff+FF)基因型频率显著低于NC组(χ2=9.934，10.895，P＜0.05)、NPDR和PDR组F等位基因频率显著低于NC组(χ2=4.899，5.714，P＜0.05);NPDR和PDR组(Ff+FF)基因型频率显著低于DM组(χ2=7.490，8.333，P＜0.01;NPDR和PDR组F等位基因频率显著低于DM组(χ2=4.448，χ2=5.227，P＜0.05);DR的多重危险因素分析示低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)和糖化血红蛋白(HbA1c)与DR的患病率呈正相关，而VDR基因FokI多态性与DR发病危险呈负相关(β=－1.027，OR= 0.343，P＜0.01，CI:0.157～0.723)。结论中国汉族人群中存在VDR基因FokI多态性，f基因可能是中国汉族糖尿病患者易于发生DR的危险遗传性标志。

VDR基因多态性;25羟基维生素D3;糖尿病视网膜病变

随着糖尿病患病率增高［1］，糖尿病慢性并发症患病率较前明显增高，其中糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见的微血管并发症之一，是糖尿病患者致盲的重要原因之一。近年研究发现维生素D对胰岛具有保护作用，25-(OH)VD3能抑制视网膜组织血管内皮生长因子和转化生长因子-1的表达［2］，其过度表达会诱导血管内皮细胞和周细胞的凋亡，破坏血－视网膜屏障。VDR基因存在多态性，VDR基因FokI多态性能上调维生素D的表达水平，关于VDR基因多态性与DR的相关性报道较少，本课题旨在阐明VDR基因FokI多态性与DR的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象按照1999年WHO的DM诊断标准和糖尿病视网膜病变分期标准，选择2010年1月至2013年12月在泰山医学院附属医院及泰安市中心医院就诊的汉族、无亲缘关系的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者254例(男120例，女134例)，分3组，仅单纯T2DM(DM)组(无糖尿病急慢性并发症)患者92例入选(男45例，女47例)，平均年龄(61.51±10.5)岁;经眼底荧光造影检查筛选，非增殖性视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR)组:80例入选(男40例，女40例)，平均年龄(60.81±11.46)岁;PDR组: 82例入选(男40例，女42例)，平均(59.95±9.88)岁;选取同期健康个体120例(男58例，女62例)作为健康对照组(normal control，NC)。

1.2 方法临床资料及生化指标检测所有受试对象均测量身高、体重，计算体重指数(BMI)，在安静状态下、坐位测量3次右上臂血压值，取其平均值，空腹抽取静脉血，用于生化和25-(OH)VD3水平检测，部分EDTA抗凝用于提取DNA，采用全自动生化分析仪测肝肾功、空腹血糖、血脂等;低压液相层析柱法测糖化血红蛋白(glycohemoglobin，HbA1c);采用酶联免疫吸附测定法检测血清中25-(OH) VD3水平(试剂盒购自大连宝生物工程有限公司)，常规行尿常规、眼底镜或眼底荧光素造影检查。EDTA抗凝全血冻存于－80℃冰箱统一提取DNA; PCR反应:上游引物5＇-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3＇，下游引物5＇-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3＇，反应条件为95℃5分钟预变性、94℃45秒变性、61℃45秒退火、72℃60秒延伸，循环35个，72℃8分钟终末延伸。DNA纯化后FokI限制性内切酶酶切反应3小时，2.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统2200下观察，以扩增片段长度鉴别基因型。

1.3 统计学处理数据采用SPSS 15.0处理，正态分布资料以均数±标准差表示，计量资料各组间的比较用单因素方差分析，计数资料的组间比较用χ2检验，糖尿病视网膜病变相关危险因素用Logistic回归分析，P≤0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR基因FokI多态性检测结果经限制性内切酶FokI酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示ff纯合子有2条片段，分别为196 bp、69 bp，FF纯合子有1条片段，片段长度为265 bp，而Ff杂合型则同时具有265 bp、196 bp和69 bp共3条片段，见图1所示。

图1 VDR基因FokI各基因型电泳图

2.2 组间VDR基因FokI基因型及等位基因分布频率NC组、DM组、NPDR组和PDR组均存在F、f 2种等位基因和FF、Ff、ff 3种基因型，其分布符合Hardy-Weinberg平衡。NC组、DM组、NPDR组和PDR组ff基因型频率分别为46.67%、50%、68.75%和69.51%，f等位基因频率分别为67.5%、64.48%、81.25%和81.71%，NPDR组ff基因型及f等位基因频率显著高于NC组(χ2= 9.934，4.899，P＜0.05)和DM组(χ2=7.49，4.448，P＜0.05);PDR组ff基因型及f等位基因频率显著高于健康对照组(χ2=10.895，5.714，P＜0.05)和糖尿病组(χ2=8.333，5.227，P＜0.05);Ff基因型在NC组、DM组、NPDR组和PDR组分布频率分别为41.67%、36.96%、25%和24.39%;F等位基因频率分别为32.5%、31.52%、18.75%和18.29%，NPDR组Ff基因型及F等位基因频率显著低于NC组(χ2=6.486，4.899，P＜0.05)和DM组(χ2=4.366，4.448，P＜0.05);PDR组Ff基因型频率及F等位基因频率低于NC组(χ2=7.327，5.714，P＜0.05)和DM组(χ2=3.986，5.227，P＜0.05);在进行FF基因型频率的组间比较时，因突变率低;各组之间均无显著差异，将携带F等位基因的基因型(即Ff基因型和FF基因型)合为一组分析(Ff+FF型)，其分布频率在NC组、DM组、NPDR组和PDR组分别为53.33%、50%、31.25%和 30.49%，NPDR组的Ff+FF型基因型频率显著低NC组DM组(χ2=9.934，7.490，P＜0.05)，PDR组Ff+FF型基因型显著低NC组和DM组(χ2= 10.895，8.333，P＜0.05)，但各种基因型分布频率和等位基因分布频率在NC组和DM组之间，NPDR组和PDR组之间无显著差异(P＞0.05)，见表1。

表1 各组间VDR基因FokI基因型及等位基因分布比较(%)

2.3 T2DM 3个亚组间临床及生化指标的比较DM组、NPDR组和PDR组之间年龄、性别构成比、BMI、血压、血脂及HbA1c水平无显著差异(P＞0.05)。

2.4 VDR FokI不同基因型之间临床及生化特征各基因型组间临床指标比较示在DM中ff、Ff、FF之间性别构成比、病程、年龄、血压、BMI、HbA1c、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol，HDLC)水平无显著差异(P＞0.05);ff基因型与Ff及FF基因型相比较，ff基因型中血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol，LDLC)增高，25-(OH)VD3表达水平降低(P＜0.05)，见表2。

2.5 不同基因型组间DR发生率的比较在T2DM中，ff基因型的DR发生率为70.89%，Ff基因型的DR发生率为54.05%，FF基因型组DR发生率为45.45%，ff基因型DR发生率高于Ff基因型组(χ2=6.615，P＜0.05)和FF基因型组(χ2=13.875，P＜0.01)，而Ff基因型组与FF基因型组相比无显著差异(χ2=1.620，P＞0.05)。

表2 a各基因型临床资料比较(¯x+s)

表2 b各基因型临床资料比较(¯x+s)

2.6 糖尿病视网膜病变发病的多重危险因素分析以有无DR为因变量，以多元Logistic回归分析多因素对DR的影响，结果显示25-OH-VD3、VDR ff基因型、BMI、HbA1c水平和LDL-c水平进入回归方程，除25-OH-VD3外OR值均大于1，为DR发病的危险因素。

3 讨论

VDR的相关研究已成为近几年研究热点，其中VDR与糖尿病视网膜病变的相关性为近年研究的热点［3］。VDR基因位于12号染色体长臂q13－14，外显子2上的第1个起始密码子ATG上T-C的变异形成了FokI位点的多态性。变异后转录活性较高，能有效结合维生素D，维生素D与受体结合后作用于效应基因，调控基因表达，实现其特定功能。

VDR基因FokI多态性存在种族差异。该研究发现泰安及周边地区汉族人存在VDR基因FokI多态性，有3种基因型分别为FF、Ff、ff，各组的VDR基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。本研究发现DM中ff基因型的DR发生率为70.89%，Ff基因型的DR发生率为54.05%，FF基因型的DR发生率为45.45%，ff基因型DR发生率高于Ff基因型组和FF基因型组，而Ff基因型组与FF基因型组相比无显著差异，提示VDR FokI多态性可能与DR发病危险性相关。

血清25-OH-VD3是目前评估人体维生素D状态的最佳指标。目前通常将血清25-OH-VD3水平正常水平定义为30～76 ng/ml，本实验结果示＜30 ng/ml占66.8%，提示泰安及周边地区人群维生素D不足较为普遍，与国内研究结果一致［4－5］。在DR患者中血清25-OH-VD3更低，这与Payne JF等［6－7］国内外报道一致相符。关于维生素D对DR的发病机制不明确，推测可能的机制为血清25-OH-VD3抑制视网膜组织中的血管内皮生长因子和转化生长因子-1的表达［2，8］，血管内皮生长因子过度表达会诱导血管内皮细胞的凋亡，增加毛细血管的通透性，破坏血—视网膜屏障，同时能诱导血管生成素-2的生成增加，共同促进视网膜新生血管的形成，从而导致视力损害［9－10］。

本课题为排除交互因素影响，以有无DR为因变量，选择可能危险因素如25-OH-VD3、VDR ff基因型、BMI、HbA1c水平和LDL-C水平等作自变量行Logistic回归分析，结果表明携带VDR FokI位点f等位基因者更易发生DR，当然基因不能从根本上决定DR的发生，但提供了环境因素发挥作用的基础。目前我国糖尿病患病率高达15.5%，此研究有利于从基因水平筛查，对携带f等位基因群体进行重点追踪及早干预，减少DR的发生有重要的现实意义。该研究样本量有限，本研究仅从单个基因位点分析对DR的影响有一定的局限性，今后将加大样本量进一步研究。本研究还显示，25-OH-VD3缺乏或不足也是DR的危险因素，推测可能适当补充维生素D能预防或改善糖尿病视网膜病变，但还需今后扩大样本量进一步深入研究。

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Relationship between Vitamin D receptor gene FokI polymorphism and diabetic retinopathy in China

HOU Li-jun HUANG Dong-hui HAN Jing-jing
(Dept.of Endocrinology，Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Taian 271000，China)

Objective:To study the Vitamin D receptor gene FokI polymorphism in Chinese Han population and to analyze the relationship between the polymorphism and diabetic retinopathy(DR).Methods:Two hundred and fifty four patients with type 2 diabetes mellitus recruited in this study were divided into NPDR group(non－proliferative diabetic retinopathy)，PDR group(proliferative diabetic retinopathy)and DM(diabetes without retinopathy)group.The normal control group consisted of 120 subjects.Genotypes were identified by PCR-RFLP among all the subjects，while other clinical parameters were measured.Serum levels of 25-(OH)VD3 were tested by the method of ELISA.Results:The frequencies of both genotype ff and allele f were significantly higher in the NPDR group and the PDR group than those in the NC group (χ2=9.934，4.899，P＜0.05;χ2=10.895，5.714，P＜0.05)and the DM group(χ2=7.49，4.448，P＜0.05;χ2=8.333，5.227，P＜0.05).However，the frequencies of genotype(Ff+FF)and allele F were significantly lower in the NPDR group and the PDR(χ2=7.490，8.333，P＜0.01 and χ2=4.448，5.227，P＜0.05).Multivariate logistic regression analysis showed that the levels of glycohemoglobin(HbA1c)，total cholesterol，low－density lipoprotein cholesterol presented a positive correlation with DR respectively，and the Vitamin D Receptor Gene FokI Polymorphism exhibited a negative correlation with DR(β=－1.027，OR=0.343，P＜0.01，CI:0.157～0.723).Conclusion:There is the presence of the VDRgene FokI polymorphism in the Han population in China，while allele f may be a protective genetic marker of DR.

Vitamin D receptor gene FokI polymorphism;serum 25-dihydroxyvitamin D;diabetic retinopathy

R587

A

1004-7115(2015)05-0490-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.05.003

2015-01-12)

侯丽君(1978－)，女，山东泰安人，主治医师，硕士，主要从事内分泌学与代谢病临床和基础研究工作。