骨髓间充质干细胞对老年大鼠受压组织炎症性损伤的影响

王艳 张穗 陈慧敏 刁波 熊毅敏 高金华

骨髓间充质干细胞对老年大鼠受压组织炎症性损伤的影响

王艳 张穗 陈慧敏 刁波 熊毅敏 高金华

目的 研究骨髓间充质干细胞（BMMSCs）对老年大鼠受压组织炎症性损伤的影响，以期为BMMSCs用于老年压疮的临床治疗提供动物实验依据。 方法 将40只SPF级雄性老年SD大鼠（喂养16月）随机分成正常组、模型组、BMMSCs移植组和生理盐水组。倒置显微镜下观察雄性Wistar大鼠的BMMSCs形态学变化；流式细胞仪检测BMMSCs表面标记物CD105、CD45、CD44、CD29的表达；生化检测基质细胞衍生因子⁃1（SDF⁃1）及白细胞介素⁃6（IL⁃6）的表达。肉眼观察BMMSCs干预后压疮疮面的愈合情况。 结果 分离所得细胞能在体外传代培养；流式细胞仪检测发现细胞阳性表达CD44、CD29，阴性表达CD105、CD45；生化实验提示：与正常组比较，模型组中SDF⁃1和IL⁃6表达量显著上升，BMMSC移植组中SDF⁃1和IL⁃6表达量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。BMMSCs移植组压疮疮面愈合远远高于生理盐水组（P＜0.01）。 结论 BMMSCs在SDF⁃1趋化作用下迁移归巢到受压损伤的组织，通过抑制细胞炎症因子IL⁃6的释放，降低损伤组织的炎症反应，在老年大鼠压疮疮面修复愈合中起着重要作用。

骨髓间充质干细胞；压疮；老年人；伤口愈合；动物模型

压疮是严重威胁老年卧床患者生活质量及生命的重要疾病，随着世界老龄化的到来，老年压疮的发生机制及防治研究已成为全球普遍关注的问题。近年研究表明，炎症介质和细胞因子的过度释放严重影响老年压疮疮面的愈合［1］。而骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）可在适宜条件下，被诱导分化为骨、肌腱、肌肉等多种中胚层来源的组织细胞［2］，通过其抗炎，增加趋化因子等作用，成为替代、修复或加强受损组织或器官功能的理想种子细胞。为此，本研究将BMMSCs移植于老年压疮大鼠模型皮肤疮面，观察它对老年压疮大鼠炎症性损伤的治疗效果及疮面愈合的影响，为将BMMSCs应用于临床老年压疮修复进行移植提供线索和动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性老年SD大鼠（喂养16月）40只，体质量330～620 g，平均（503±82.5）g。购自湖北实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（鄂）2008－0004。

1.1.2 试剂：F12细胞培养基（DMEM）购自美国Hy⁃clone；胎牛血清及0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco；PVDF膜，显影胶片，Percoll分离液（比重1.073）购自碧云天公司，荧光标记小鼠抗大鼠单克隆抗体CD29、CD44、CD45及CD105购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs的体外分离及原代培养：断颈处死Wistar大鼠，超净台上从髂骨或胸骨抽取供者骨髓，用肝素抗凝，摇匀，用D⁃Hanks液或生理盐水稀释骨髓1～2倍；取Ficoll⁃Hypaque（有成品供应，相对密度为1.077 ±0.001），放入离心管；混匀稀释后的骨髓液，沿试管壁缓缓加入，使稀释血液重叠于分层液上，稀释的血液与分离液体积比例约为2∶1；用水平离心机以900 r／min（室温）离心30 min，离心后管内容物分为3层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和多核细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层，呈白膜状；用毛细吸管轻轻插到白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一试管中；加入5倍以上体积D⁃Hanks液，混匀，1200 r／min离心10 min，吸弃上清液，重复洗涤2次；末次离心后，吸尽上清。用于干细胞元代培养液重悬细胞。原代培养24 h后，半量换液，去除未贴壁的造血细胞；每3～4 d换液1次；7～10 d后待细胞生长接近80%～90%后，用0.25%胰酶（含0.01%EDTA）消化，消化时间≤2 min。

1.2.2 BMMSCs的鉴定：取扩增一代的间充质干细胞，去掉培养液，PBS洗2遍，用1∶1的0.25%的胰蛋白酶和0.2%EDTA混合液消化，用含20%BSA的PBS洗涤后制成浓度为1.0×106／ml的单细胞悬液，每个Eppendof管加500 μl细胞悬液，共3个检测管。1号管为阴性对照（不加抗体），2号管为同型对照（分别加入5 μl抗鼠的IgG1⁃FITC、APC、PE、PerCP／Cy5.5），3号管为检测管（分别加入5 μl抗人的CD105⁃PerCP／ Cy5.5、CD45⁃APC、CD44⁃FITC、CD29⁃PE）。室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.2.3 老年大鼠压疮模型制作：40只老年大鼠均禁食12 h，用10%水合氯醛按300 mg／kg腹腔注射麻醉后，其中30只用6%的硫化钠溶液轻柔脱除以左侧大转子为中心直径5 cm范围的被毛，将大鼠仰卧于设计好的简易加压装置上，该装置由固定和加压两部分组成。大鼠的四肢用胶布固定于底盘上，加压部分通过倒立的铁钉来完成。用游离卡尺测量大铁钉钉帽的直径为0.64 cm、0.62 cm、0.59 cm、0.60 cm、0.58 cm、0.63 cm、0.60 cm、0.61 cm，测8个大铁钉钉帽直径后取平均值为0.60 cm。同时将造模时施加在老年SD大鼠身上的压力设为46 kPa，施压时间12 h［3］。以皮肤破溃，可见渗液，呈不规则的凹坑作为判断压疮溃疡期的标准［4］。期间每只大鼠单笼饲养，自由饮水与进食，切口喷洒抗生素溶液预防感染。另外10只作为正常组不进行造模，实验结束后直接颈动脉取血后实施安乐死。

1.2.4 动物实验分组及处理：将30只造模成功老年大鼠随机分成3组：模型组、生理盐水组及BMMSCs移植组，另外10只作为正常组，各组间大鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。分笼喂养，房间温度保持在22℃～24℃，湿度保持在50%～70%，明暗周期为12 h，自由饮水和进食。生理盐水组及BMMSCs移植组大鼠疮面先用1%碘伏清创，再以无菌生理盐水棉球擦洗创面。BMMSCs移植组用1 ml注射器给其尾静脉注射第4代生长良好的、细胞浓度为2×105／ml的BMMSCs。生理盐水组用1 ml注射器给其尾静脉注射生理盐水。正常组模型组不予任何处理。2周后直接颈动脉取血后实施安乐死。

1.2.5 压疮疮面肉眼观察及生化指标检查：包括疮面收缩大小及潜行程度、局部炎症、肉芽组织及上皮愈合情况。各组大鼠安乐死后，均切取疮面及周围0.5 cm的正常全层皮肤及部分肌层组织（正常组位置与其余3组同），4℃冰盐水洗净，滤纸吸干置于－70℃保存。另取相同部位的肌肉组织，4℃冰盐水中快速洗去血液，10%甲醛液固定、脱水、石蜡包埋、切片、行HE染色及TUNEL荧光标记。冻存的样品同一天同一批按组织质量（g）／生理盐水毫升数（ml）＝1∶9配备成10%肌肉匀浆，4℃环境下以3500 r／min离心10 min，仔细收集上清液保存待测。严格按照各试剂盒提供的说明书检测大鼠肌肉组织中基质细胞衍生因子⁃1（stromal cell derivedfactor⁃1，SDF⁃1）和白细胞介素⁃6（interleukin⁃6，IL⁃6）的表达。

1.2.6 溃疡愈合率的观察：压疮成模当天及BMMSCs移植及生理盐水注射后第5天、第10天、第14天用康乐宝伤口尺测量并记录2组疮面愈合面积（原始疮面面积－剩余未愈合的面积），计算疮面愈合率（疮面愈合率＝疮面愈合面积／原疮面面积×100%）。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量数据资料用¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法（方差齐时）和Tamhane's T2法（方差不齐时），组间愈合率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMMSCs形态学观察 原代培养：初种的细胞呈圆球状分散悬浮于培养液中。24 h即可见有贴壁的间充质样细胞，并有集落形成。同时有大量的破骨样细胞混杂，72 h换液去除非黏附细胞后，留下来的细胞大多贴壁生长。贴壁的细胞呈单层片状分布，或以集落性放射状生长，形态较均一，呈饱满的梭形、纺锤形单个核，两端有细长突起，折光性强，增生旺盛，同时有大量的破骨样细胞混杂。原代培养7～10 d的细胞相互融合至80%～90%即可消化传代，以含体积分数为10%胎牛血清的LG⁃DMEM培养液继续培养。传至第4代时，大部分细胞（包括破骨样细胞）逐渐被去除，剩下形态较为单一的成纤维样细胞，见图1。

2.2 大鼠BMMSCs的流式细胞仪检测 结果显示，第4代细胞均一性较好，达99%以上，造血干细胞的表面标记CD45和CD105表达呈阴性，而CD29和CD44表达呈阳性，阳性率为88.62%。说明传代贴壁生长的梭形细胞为BMMSCs。见图2。

图1 分离培养的BMMSCs

2.3 疮面肉眼观察及愈合率比较 BMMSCs组大鼠压疮疮面渗出液减少，肉芽组织生长迅速，色泽鲜艳，呈淡红色，疮面干燥，伤后第5天创面已明显收缩。第14天已基本愈合。生理盐水组压疮疮面愈合缓慢，肉芽生长相对迟缓，色泽稍暗，伤后第10天仅愈合近半，第14天仍有较大部分疮面未痊愈。2组愈合率比较见表1。

图2 BMMSCs流式鉴定图

表1 BMMSCs及生理盐水组溃疡疮面动态愈合率比较（x¯±s，%，n＝10）

2.4 各组IL⁃6、SDF⁃1含量的变化 实验结果显示，与正常组比较，模型组中IL⁃6和SDF⁃1表达水平显著上升（P＜0.01）。与模型组比较，BMMSCs移植组中IL⁃6和SDF⁃1表达水平显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）；而生理盐水组中IL⁃6表达水平增高（P＜0.01），SDF⁃1表达量无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

近期研究显示［5］：老年压疮的发生是多因素共同参与的复杂病理生理过程，包括氧化应激反应，炎症反应、细胞凋亡等。其中炎症介质和细胞因子的过度释放及其相互作用在老年压疮发生发展、压疮疮面愈合中起重要作用。

表2 各组IL⁃6、SDF⁃1含量的变化（¯x±s，n＝10）

SDF⁃1属于CXC趋化因子家族成员，由骨髓基质细胞产生，低氧诱导表达［7］。当局部皮肤持续受压导致缺血缺氧状况后，损伤部位SDF⁃1的分泌迅速增加。SDF⁃1具有强烈的趋化作用，介导炎症细胞集聚、黏附、穿过内皮细胞跨膜迁移、到达病灶，促使受损组织发生局部炎症反应。炎症区域产生的趋化因子对浸润性细胞的迁移及活化是引起组织病理损伤的基础。IL⁃6是炎症反应的主要标志之一［1］，除对血管内皮细胞及炎性细胞具有直接的激活和毒性作用外，更主要的是诱导急性期蛋白的合成，催化和放大炎性反应。同时在炎症条件下IL⁃6等多种递质，反过来又可促使炎症细胞大量分泌SDF⁃1，形成复杂的炎症介质网络系统，激发细胞因子级联反应的发生或“瀑布效应”，加剧组织炎症损伤过程［8］。

我们从老年大鼠髂骨抽取供者骨髓，分离BMMSCs并在体外进行增殖培养，流式细胞仪鉴定发现其细胞表面分子CD29、CD44表达阳性，CD45、CD105表达阴性，提示本研究采用密度梯度离心法获得较纯化的BMMSCs。作为一种来源于中胚层的成体干细胞，BMMSCs具有向损伤组织、缺血区域定向迁移的能力，称之为“归巢”（homing），这种“归巢”特性使得组织受损时，骨髓会迅速动员多种干细胞迁移至病变处，产生自然的代偿性修复；而外源性间充质干细胞也会归巢在损伤靶器官中，发挥生物学作用，它是体内干细胞修复损伤或替代坏死结构的基础［10］。本实验显示：BMMSCs移植组大鼠压疮疮面渗出液减少，肉芽组织生长迅速，色泽鲜艳，呈淡红色，疮面干燥，第14天全部愈合。生理盐水组疮面愈合缓慢，肉芽生长相对迟缓，色泽稍暗，伤后第14天疮面大部分仍未痊愈。结合生化实验结果，原因可能为SDF⁃1既是调节局部炎症的重要趋化因子，也对BMMSCs归巢具有介导促进作用［10⁃11］，它所介导的BMMSCs迁移归巢到受压损伤的组织后，可能通过某些途径诱导辅助性T淋巴细胞TH1向TH2细胞转化，抑制细胞炎症因子IL⁃6的释放，阻止炎症相关细胞如中性粒细胞的聚集、激活，降低损伤组织的炎症反应，启动受损组织修复。同时BMMSCs因本身强大的可塑性分化为皮肤组织的各种细胞，如成纤维细胞、表皮细胞和内皮细胞、皮肤附属器细胞等共同参与疮面修复，不仅促进老年压疮愈合速度，而且还可提高老年压疮的愈合质量。

综上所述，BMMSCs在SDF⁃1趋化作用下可迁移归巢到受压损伤的组织，通过抑制细胞炎症因子IL⁃6的释放，降低损伤组织的炎症反应，在老年大鼠压疮疮面修复愈合中起着重要作用，因而可作为候选的种子细胞用于老年压疮的治疗。然而，有关BMMSCs如何发挥作用，是否对老年压疮各个发病阶段都发挥作用、以及植入后在体内的最终命运等等问题，还需要研究人员进一步深入探讨。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on inflammatory injury in aged rats tissue under pressure

WANG Yan，CHEN Hui⁃min，XIONG Yi⁃min，GAO Jin⁃hua．
Department of Digestive Diseases；ZHANG Sui．Department of Opera⁃tion；DIAO Bo．Department of Neurosurgery Experimental Center，Wuhan General Hospital of Guangzhou Command，PLA，Wuhan 430070，China．

Objective To study the effect of bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSCs）on inflammatory injury in tissues of aged rats under pressure and to provide a new source of seeding cells for clinical uses. Methods Forty SPF⁃graded male SD rats，which were fed for 16 months，were randomly divided into normal group，model group，BMMSCs trans⁃plantation group and saline group.The morphological changes of BMMSCs of male Wistar rats were observed under the invert⁃ed microscope；The expression of surface markers⁃CD105，CD45，CD44 and CD29 of BMMSCs were detected by flow cytome⁃try.The levels of interleukin⁃6（IL⁃6）and stromal cell derived factor⁃1（SDF⁃1）were also measured.And the healing rate of the pressure ulcer after intervention were observed. Results The isolated cells were able to be cultured in vitro；the expres⁃sions of CD44 and CD29 were positive while the expression of CD105 and CD45 were negative；The concentration of SDF⁃1 and IL⁃6 of the rats in the model group were significantly higher than those in the normal group（P＜0.01）while those in the BMMSCs transplantation group were significantly lower than those in the model group（P＜0.01）.The healing rate of the BMMSCs transplantation group was much higher than that of the saline group. Conclusions BMMSCs is able to move to in⁃juried tissues by the chemotaxis of SDF⁃1，and reduce the inflammatory response in injuried tissues by inhibiting the release of IL⁃6，therefore，BMMSCs plays an important role in healing of pressure ulcers in the aged rats.

bone marrow mesenchymal stem cells；pressure ulcers；aged；wound healing；animal model

R 632.1

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.04.008

2014⁃06⁃17）

湖北省自然科学基金资助项目（2012FFB06806）；湖北省卫生厅2013⁃2014年度科研项目（HL2012⁃8）

430070湖北省武汉市，中国人民解放军广州军区武汉总医院消化内科（王艳，陈慧敏，熊毅敏，高金华），手术室（张穗），神经外科医学实验中心（刁波）