单侧迷走神经干刺激对心力衰竭犬心室肌自主神经分布和功能失衡的改善研究

阿不都热合曼·米吉提 戴晓燕 阿地力江·托合提

·论 著·

单侧迷走神经干刺激对心力衰竭犬心室肌自主神经分布和功能失衡的改善研究

阿不都热合曼·米吉提 戴晓燕 阿地力江·托合提

目的 探讨单侧迷走神经干刺激增加迷走神经活性，对心力衰竭（心衰）犬自主神经分布和功能及心功能的影响。 方法 杂种犬18只，随机分为假手术组、心衰组和迷走刺激组，每组6只。假手术组置入起搏器不行起搏，心衰组及迷走刺激组建立心衰模型，心衰组右心室置入起搏器行250次／min快速起搏37 d，迷走刺激组置入起搏器起搏30 d后给予右侧迷走神经干20 Hz刺激7 d。行超声心动图检查平均动脉压（MAP）和左室射血分数（LVEF），并行电生理仪监测静息心率（HR）变化。采用免疫组织化学法检测酪氨酸羟化酶（TH）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）阳性纤维表达情况。

慢性心力衰竭；迷走神经干刺激；酪氨酸羟化酶；乙酰胆碱转移酶

慢性心力衰竭（心衰）是各种器质性心脏病的主要并发症，死亡率高，而室性心律失常致死占心衰总死亡数的40%～50%［1］。国内外大量研究显示：自主神经功能失衡在心衰的发病中占有重要地位，与心衰时心律失常、心室重构及猝死密切相关［2］。已有大量基础研究和临床证据表明迷走神经活性与心衰的结局之间存在相关性，但利用其活性治疗心衰的研究尚处于初始阶段［3⁃5］。2个潜在的治疗方向己经被发现：一是使用慢性电刺激迷走神经，另一个是使用苯并噻氮类药物（钙离子拮抗剂）。本研究在快速起搏犬右心室诱发心衰模型的基础上，探讨刺激单侧迷走神经逆转心衰犬心室肌自主神经重构的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 成年健康杂种犬18只，雌雄不限，体质量（18.00±2.66）kg，由新疆医科大学动物中心提供，动物质量属于一级标准。随机分为假手术组：雌性2只，雄性4只，平均体质量（18.29±3.54）kg；心衰组：雌性3只，雄性3只，平均体质量（18.09±2.14）kg；心衰＋迷走神经刺激组（迷走刺激组）：雌性2只，雄性4只，平均体质量（17.85±2.86）kg。假手术组分离右侧颈外静脉和迷走神经干，置入起搏器不行起搏刺激；心衰组给予起搏器刺激30 d后，分离迷走神经干后继续起搏7 d；迷走刺激组给予起搏器刺激30 d后，分离迷走神经干置入电极刺激神经同时继续起搏7 d。实验设计及实施均经武汉大学人民医院动物伦理委员会审核批准。

1.2 杂种犬慢性心衰模型制作［6］3%戊巴比妥钠按

30 mg／kg静脉注射麻醉犬，术中4 mg／次静脉注射维持。建立气管插管。犬右侧颈部去毛，常规消毒铺巾，在右颈部做一5 cm切口，分离出右侧颈外静脉，仔细剥离静脉鞘后结扎远心端，用眼科剪剪开静脉直径的1／4～1／3，静脉提钩提起静脉壁时将电极头小心送入静脉，将起搏电极沿静脉系统送入右心室尖，LEAD2000心内电生理仪（锦江电子）显示aVR导联呈大R波。连接并开启起搏器（250次／min），缝合皮肤，打开起搏器开关实行起搏心律。术中及术后3 d均给予160万U青霉素2次／d肌肉注射，预防切口及囊袋感染。30 d后，犬出现不同程度的食欲下降、活动减少、呼吸加快等心衰症状，平均动脉压（mean artery pressure，MAP）＜60 mmHg，左室射血分数（LVEF）＜50%证实心衰模型建立成功。犬在起搏器关闭和麻醉状态下，完成右侧迷走神经刺激器安装后更换起搏器，以190次／min起搏频率维持心衰7 d。

1.3 迷走神经刺激方法 分离右侧颈部迷走神经，植入迷走神经刺激电极，电极的另一侧连接神经刺激器。刺激参数为：电压4～8 V、脉宽1 ms、频率20 Hz。刺激时心率降低＞30%为刺激有效，刺激效果不达标时调整刺激电压、频率和刺激部位。置入神经刺激仪调试后缝合切口，持续刺激7 d。

1.4 心脏超声检查 采用DESAOTE超声仪和10 S探头，频率10 MHz，扫查深度5 cm，检查前关闭起搏器。测量LVEF、MAP，并行电生理仪监测静息心率（heart rate，HR）变化。

1.5 酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和乙酰胆碱转移酶（cholineacetyl⁃transferase，ChAT）免疫组化检测 各实验组于在体实验结束后取左心室前壁组织进行石蜡包埋，切片。采用SP免疫染色法染色。阴性对照以PBS代替一抗，应用计算机辅助图像分析系统（motic images 3000）计算神经密度。TH和ChAT着色表现为胞浆染成棕黄色为阳性结果。依显色程度分为：阴性无显色，浅棕黄色为阳性，棕褐色为强阳性。神经密度以神经纤维面积与总检测面积比值表示（μm2／mm2），切片全部面积被分割成连续的1024 μm2×768 mm2大小的独立视野，所有视野神经密度的平均值为该切片平均神经密度，每个切片中选择5个神经密度最大和5个神经密度最小的视野，神经密度均值之差为局部神经分布的不均一性。

1.6 统计学处理 应用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 快速起搏心室诱发心衰模型完成情况 快速右心室起搏30 d后，心衰组和迷走刺激组MAP＜60 mm⁃Hg，LVEF＜50%，结合犬呼吸加快，心率加速，食欲下降等症状，心衰模型建立成功。

2.2 3组MAP、LVEF和HR比较 基础状态各组MAP、LVEF和HR比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验30 d后，心衰组和迷走刺激组MAP和LVEF值比假手术组减小，HR比假手术组增快，差异有统计学意义（P＜0.05）。心衰组MAP、LVEF和HR与迷走刺激组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。实验37 d后，心衰组MAP和LVEF值比假手术组和迷走刺激组显著减小，HR比假手术组和迷走刺激组显著增快，差异有统计学意义（P＜0.05），迷走刺激组MAP、LVEF和HR与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组犬MAP、HR及LVEF比较（¯x±s，n＝6）

2.3 实验37 d各组犬心室肌神经分布不均一性比较

与假手术组比较，心衰组TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05），迷走刺激组TH和ChAT阳性神经密度不均一未见明显改变，差异无统计学意义（P均＞0.05）。假手术组TH和ChAT神经纤维特染棕色条索状阳性染色表达；心衰组TH棕色和ChAT浅棕色条索状蛋白表达减少；迷走刺激组可见浅棕色条索状TH表达和大量深棕色条索状ChAT阳性染色表达。见表2和图1，2。

表2 实验37 d后各组犬心室自主神经分布不均一性（¯x±s，μm2／mm2，n＝6）

3 讨论

图1 实验37 d各组犬左心室前壁TH阳性神经纤维表达（×400）

图2 实验37 d各组犬左心室前壁ChAT阳性神经纤维表达（×400）

目前慢性心衰动物模型的制作方法较多，有压力或者容量负荷诱导心衰模型、缺血性心肌病模型、心脏快速起搏心衰模型、药物诱导的心肌病模型、心肌肥厚和心衰转基因动物模型等［7］。心衰动物模型的建立对研究心衰的发病机制、病理生理及疾病预防和治疗起重要作用。长期快速右心室起搏（＞200次／min）导致的心衰模型酷似扩张性心肌病，本研究此种模型的优点是制作模型的方法较简单并且创伤小，起搏诱导的心衰血流动力学，神经内分泌水平与人的心衰相似，可以用来研究慢性心衰不同阶段的病理生理和分子生物学特征。本实验结果显示，快速右心室起搏30 d后，心衰组和迷走刺激组犬MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰犬模型建立成功，并且心衰组30 d和37 d时MAP和LVEF值比假手术组持续减小，提示心衰的严重程度随起搏时间延长呈逐步进展的趋势。实验37 d时，迷走刺激组MAP和LVEF值比心衰组增加，与假手术组比较，差异无统计学意义，提示迷走神经干刺激可以改善心衰心功能和血流动力学。

临床上评价心衰患者迷走神经活性是很困难的，目前仅能通过观察HR加快，心率变异性降低尤其是高频成分降低，或者低频高频降低间接实现［8］。HR可以反映迷走神经功能，粗略评估自主神经平衡。大规模临床实验表明，静息HR＞90次／min比HR＜60次／min人群的心血管死亡率高2倍［9］。本研究显示，实验30 d时心衰组HR比假手术组明显增加。实验结果提示，心衰后自主神经功能失衡，迷走神经功能下降，导致HR增加。

在收缩性心衰时，神经和体液系统均被激活，以维持心功能。已有较充分的证据显示，心衰患者的迷走神经调控亦出现异常。目前，已有多种药物对心衰患者交感神经的过度激活有抑制作用，如β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等。但迷走神经调节异常的改善尚无有效药物，因此，本研究将研究方向转向了迷走神经调节的器械治疗。本研究结果显示，心衰是与迷走神经活动减弱密切相关的。迷走神经刺激可能会成为另一种有效治疗心衰的方法。有研究表示超过3月的迷走神经刺激可以显著减少心室体积，增加心室射血分数［10］。有研究利用迷走神经刺激器，对32例心衰患者进行长期刺激后发现：大多数患者的NYHA心功能分级至少提高一个级别，HR明显下降，且随时间延长而易于维持，生活质量、6 min步行距离和心脏彩超指标明显好转［11］。本研究证实，心衰组犬出现自主神经分布的不均一性，心衰组TH和ChAT阳性神经密度不均一均明显增加，TH纤维蛋白表达增加和ChAT纤维蛋白表达下降；经迷走神经干刺激后，心室肌自主神经分布的失衡改善，ChAT纤维蛋白表达增加，同时血流动力学指标，射血分数及HR均恢复。本研究结果提示，慢性迷走神经刺激可以作为临床潜在的逆转心室重构的治疗方向，并为迷走神经刺激作为治疗心衰的临床前期基础研究提供理论依据。

［1］ Hunt SA，Abraham WT，Chin MH，et al.2009 focused up⁃date incorporated into the ACC／AHA guidelines for the diag⁃nosis and management of heart failure in adults：a report of the American college of cardiology foundation／American heart association task force on practice guidelines.Developed in collaboration with the international society for heart and lung transplantation［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（15）：e1⁃e90.

［2］ Ogawa M，Zhou S，Tan AY，et al.Left stellate ganglion and vagal nerve activity and cardiac arrhythmias in ambulatory dogs with pacing⁃induced congestive heart failure［J］.J Am Coll Cardiol，2007，50（4）：335⁃343.

［3］ La Rovere MT，Pinna GD，Maestri R，et al.Prognostic im⁃plications of baroreflex sensitivity in heart failure patients in the beta⁃blocking era［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53（2）：193.

［4］ Dunlap ME，Bibevski S，Rosenberry TL，et al.Mechanisms of altered vagal control in heart failure：influence of musca⁃rinic receptors and acetylcholinesterase activity［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（4）：H1632⁃H1640.

［5］ 孙艳侠，王国干.心力衰竭动物模型研究进展［J］.中国比较医学杂志，2011，21（7）：73⁃78.

［6］ 惠杰，沈振亚，焦鹏，等.快速右室起搏建立动物心力衰竭模型［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2004，18（6）：470⁃472.

［7］ 季萌，周祁娜，侯月梅.心力衰竭中迷走神经活性变化的研究进展［J］.中国心脏起搏与心电生理杂志，2012，26（6）：547⁃549.

［8］ Thayer JF，Lane RD.The role of vagal function in the risk for cardiovascular disease and mortality［J］.Biol Psychol，2007，74（2）：224⁃242.

［9］ Zhang Y，Popovic ZB，Bibevski S，et al.Chronic vagus nerve stimulation improves autonomic control and attenuates systemic inflammation and heart failure progression in a canine high⁃rate pacing model［J］.Circ Heart Fail，2009，2（6）：692.

［10］De Ferrari GM，Schwartz PJ.Vagus nerve stimulation：from pre⁃clinical to clinicalapplication：challenges and future di⁃rections［J］.Heart Fail Rev，2011，16（2）：195⁃203.

［11］Dibner⁃Dunlap ME，Thames MD.Baroreflex control of renal sympathetic nerveactivity is preserved in heart failure despite reduced arterial baroreceptor sensitivity［J］.Circ Res，1989，65（6）：1526⁃1535.

Effects of unilateral vagus nerve stimulation on the improvement of ventricular autonomic nerve distribution and functional imbalance in canine with heart failure

Objective To investigate the effects of unilateral vagus nerve stimulation on vagal activity，autonomic nerve distri⁃bution and function and cardiac function in canine with heart failure. Methods Eighteen dogs were randomly divided into sham op⁃eration group，heart failure group and vagal stimulation group，with 6 dogs in each group.Sham operation group received pacemaker implantation but no pacing；Heart failure group were implanted pacemaker at right ventricular and received 250 times／min pacing for 37 d to establish CHF model；Vagal stimulation group were implanted pacemaker and received 250 times／min pacing for 30 d，then the right vagus nerve was stimulated for 7 d（frequency：20 Hz）.Left ventricular ejection fraction（LVEF）and mean arterial pressure（MAP）were examined with ultrasonic apparatus.Resting heart rate（HR）was recorded with electrocardiogram monitor.The expres⁃sion of tyrosine hydroxylase（TH）and cholineacetyl⁃transferase（ChAT）protein were detected by immuno⁃histochemistry. Results After 30 d of right ventricular rapid pacing，MAP＜60 mmHg，and LVEF＜50%were defined as successful heart failure model.After 30 d，compared to sham operation group，MAP and LVEF decreased and resting HR increased significantly in heart failure group and vagal stimulation group（P＜0.05）.After 37 d，compared with the sham operation group and vagal stimulation group，MAP and LVEF was significantly reduced and resting HR significantly increased（P＜0.05）.TH and ChAT positive nerve density heterogeneity statisti⁃cally increased in heart failure group（P＜0.05）.The muscle fibers with positive expression of TH were increased and the muscle fi⁃bers with positive expression of ChAT were decreased in heart failure group.While the mucle fibers with postive TH expression or ChA T expression were increased in vagal stimutation group. Conclusions The unilateral vagus nerve stimulation increases vagus nerve activity，slows HR，recovers autonomic nerve homogeneous and function imbalance，improves heart function in heart failure canines.

chronic heart failure；vagus nerve stimula⁃tion；tyrosine hydroxylase；acetylcholine transferase

R 541.6

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2015.04.006 Abudureheman·Mijiti．Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；DAI Xiao⁃yan，Adilijiang·Tuoheti．Department of Cardiology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumqi 830011，China

2014⁃05⁃05）

830054新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆医科大学（阿不都热合曼·米吉提），830011新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市，新疆维吾尔自治区人民医院（戴晓燕，阿地力江·托合提）

戴晓燕，Email：1961459521＠qq.com

结果 行犬右心室快速起搏30 d后，MAP＜60 mmHg，LVEF＜50%，心衰模型成功建立。实验30 d后，心衰组和迷走刺激组MAP和LVEF值比假手术组减小，HR比假手术组增快，差异有统计学意义（P均＜0.05）。实验37 d后，与假手术组和迷走刺激组比较，心衰组MAP和LVEF值显著减小，HR显著增快，TH和ChAT阳性神经密度不均一明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。心衰组TH棕色条索状阳性纤维表达增加，ChAT浅棕色条索状阳性纤维表达减少；迷走刺激组可见浅棕色条索状TH表达和大量深棕色条索状ChAT阳性纤维表达。 结论 单侧迷走神经干刺激能增加心衰犬迷走神经活性，减慢心率，恢复自主神经不均一性分布和功能失衡，改善心功能。