多色流式细胞术对正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞与传统T细胞间的相关性研究＊

姚春艳， 姜丽娜， 汪洪涛， 金齐力， 李柏青△

多色流式细胞术对正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞与传统T细胞间的相关性研究＊

姚春艳1， 姜丽娜2， 汪洪涛1， 金齐力3， 李柏青1△

1蚌埠医学院医学检验系免疫学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠 233000
2蚌埠医学院病理生理学教研室，蚌埠 233000
3蚌埠医学院第二附属医院检验科，蚌埠 233000

目的 探讨正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞与传统CD3＋T细胞在含量和亚群上的关系。方法 采用五色荧光染色和流式细胞术检测TCRVα24＋NKT细胞与传统CD3＋T细胞在30例正常人外周血中所占比例，两群细胞中各亚群（CD4亚群、CD8亚群、双阴性亚群及CD45RA初始细胞亚群）在各自细胞群体中所占比例，统计软件分析两群细胞间各指标的差异及相关性。结果 NKT细胞在正常人外周血中所占比例为0.35%（0.10%～1.50%），CD3＋T细胞比例为58.4%（43.2%～72.5%）；在Va24＋NKT细胞中CD4亚群所占比例为69.1%（21.3%～90.9%）、CD8亚群为15.0%（4.5%～76.2%）、双阴性亚群为9.5%（0.7%～69.4%）、CD45RA初始细胞亚群为32.4%（6.8%～54.0%），在CD3＋T细胞中CD4亚群所占比例为54.7%（27.0%～74.7%）、CD8亚群为33.7%（19.9%～48.2%）、双阴性亚群为10.2%（1.9%～24.4%）、CD45RA初始细胞亚群为39.8%（10.3%～63.0%）。两群细胞间除CD4亚群和CD45RA亚群具有显著相关性（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01），其余各指标均无相关性。CD4＋NKT细胞含量与总NKT细胞含量呈显著负相关，而CD8＋NKT与总NKT细胞呈显著正相关（r＝－0.680 2，P＜0.01；r＝0.401 7，P＜0.05）。结论 正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞与传统T细胞间除在CD4亚群和CD45RA初始细胞亚群间有显著相关外，其余各亚群相关较少。

流式细胞术； NKT细胞； 相关性

自然杀伤T细胞（natural killer T cells，NKT细胞）是一类表达NK细胞相关表面分子的特殊T淋巴细胞亚群，该群细胞具有以下主要特征:首先，NKT细胞TCR的Vα链表达较恒定，在小鼠恒定表达Vα14－Jα18链，且通常与Vβ8.2、Vβ2或Vβ7共表达［1］，在人类则恒定表达Vα24－Jα18－Vβ11链［2］，因此NKT细胞又被称为iNKT细胞（invariant NKT cell，iNKT细胞），由于NK细胞通常情况下不表达TCR，所以这也是NKT细胞区别于NK细胞的主要特点之一；其次，NKT细胞只能识别由CD1d分子提呈的糖脂类抗原，而非传统T细胞所识别的由MHCⅠ类或Ⅱ类分子提呈的蛋白质类抗原［3］，活化后的NKT细胞可以迅速分泌IFN－γ、IL－4、IL－17等细胞因子，从而发挥重要的调节功能［4－6］。

NKT细胞与传统T细胞间除具有以上区别外，也存在某种联系。如NKT细胞通常被认为来源于胸腺［7］，这与传统T细胞相同；CD4和CD8分子是划分传统T细胞的分化发育阶段的标志分子，通常根据CD4和CD8分子的表达情况可以对T细胞进行分类，而NKT细胞也可按此法进行分类，可将NKT细胞划分为CD4＋、CD8＋和CD4－CD8－双阴性NKT细胞；此外，研究表明在小鼠体内分布有传统T细胞的各器官或组织内都分布着不同数量的NKT细胞［8］。

为了进一步弄清人体内NKT细胞与传统T细胞间的关系，本实验对正常人外周血中的NKT细胞和传统T细胞的含量及其各亚群所占比例进行检测和分析，以期为进一步揭示人体NKT细胞与传统T细胞间的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本实验所用的正常人外周血细胞均来自蚌埠医学院健康教工和学生，年龄18～28岁，平均年龄（21 ±3）岁，共30例，其中男性18例，女性12例。

1.2 主要材料、试剂

所用流式荧光抗体如下:FITC标记的抗人CD45RA（IgG2b，clone MEM－56），PeCy5.5标记的抗人CD4（IgG2a，clone S3.5），APC标记的抗人CD8（IgG2a，clone OKT8），APC－AF750标记的抗人CD3（IgG2a，clone S4.1）为Caltag公司产品；PE标记的抗人TCRVα24（IgG1，clone C15）为Immunotech公司产品。流式细胞仪（FACSAria），购自美国BD公司。

1.3 检测方法

无菌抽取正常人外周血5mL，肝素抗凝，采用五色荧光染色和流式细胞术进行检测。染色时测试管内依次加入一定量的流式抗体CD45RA FITC／TCRVα24PE／CD4PeCy5.5／CD8APC／CD3APCAF750，同时加染空白对照管，同型对照管和各荧光补偿管，每管加入压积红细胞100μL，混匀后室温避光反应20min，各管加1倍溶血剂（BD公司）3 mL，室温避光反应10min后离心弃上清，染色缓冲液洗2次，0.5mL 2%多聚甲醛固定细胞30min后于24h内上流式细胞仪获取数据，每管获取细胞数设置为iNKT细胞门内500个；采用FACSDiva软件分析流式数据。

1.4 统计学分析

数据处理采用GraphPab Prism 5.0统计软件，结果以中位数表示，采用Mann－Whitney test检验两群细胞间的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义；采用Pearson相关性分析分析两群细胞间的相关性，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞含量与传统T细胞含量的相关性分析

30例正常人外周血淋巴细胞中CD3＋TCRVα24＋NKT细胞所占比例为0.35%（0.10%～1.50%），CD3＋T细胞比例为58.4%（43.2%～72.5%）。两种细胞的相对含量间无显著相关（r＝0.024 98，P＝0.895 7）。见图1。

图1 正常人外周血中NKT细胞与T细胞含量间的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of the frequency between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in the peripheral blood of normal persons

2.2 正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞各亚群与传统T细胞各亚群间的相关性分析

CD4和CD8是划分T细胞分化发育阶段的标志分子，根据CD4和CD8分子表达情况，可以将T淋巴细胞和NKT细胞分为CD4阳性，CD8阳性，双阴性（DN）3个亚群，结果发现NKT细胞的上述3个亚群所占比例分别为69.1%（21.3%～90.9%）、15.0%（4.5%～76.2%）、9.5%（0.7%～69.4%），而T细胞的3亚群所占比例分别为54.7%（27.0%～74.7%）、33.7%（19.9%～48.2%）、10.2%（1.9%～24.4%）。CD45RA是初始细胞的表面标志之一，CD45RA阳性的NKT细胞即初始NKT细胞在正常人外周血中含量为32.4%（6.8%～54.0%），传统初始T细胞的含量为39.8%（10.3%～63.0%）。分析发现，正常人NKT细胞中CD4亚群比例显著高于传统T细胞中CD4亚群的比例（P＜0.01），而CD8亚群和初始NKT细胞的比例却显著低于传统T细胞相应亚群比例（P＜0.01，P＜0.05），NKT细胞的CD4亚群及初始细胞亚群比例与传统T细胞相应亚群间呈显著正相关（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01），其它各亚群无显著相关性。见图2、3。

图2 NKT细胞及传统T细胞中各亚群比较Fig.2 Comparison of the proportion of each subset between NKT cells and conventional T cells

图3 NKT细胞及传统T细胞中各亚群间相关性分析Fig.3 Correlation analysis of the proportion of each subset between NKT cells and conventional T cells

2.3 TCRVα24＋NKT细胞中CD4／CD8与传统T细胞CD4／CD8的相关性分析

CD4／CD8在TCRVα24＋NKT细胞中为4.725（0.28～14.90），显著高于在CD3＋T细胞中的比值1.60（0.59～3.75）（P＜0.01），但两者间无显著相关性（r＝0.321 1，P＞0.05）。见图4。

图4 NKT细胞和传统T细胞中CD4／CD8比值比较及相关性分析Fig.4 Comparison of CD4／CD8between NKT cells and conventional T cells and the correlation analysis

2.4 正常人外周血中NKT细胞各亚群含量与NKT细胞含量间及传统T细胞各亚群含量与T细胞含量间相关性分析

经Pearson相关性分析发现，在NKT细胞群体中CD4亚群所占比例与总NKT细胞比例之间呈显著负相关（r＝－0.680 2，P＜0.01），而CD8亚群所占比例与总NKT细胞比例之间却呈显著正相关（r＝0.401 7，P＜0.05）。而传统T细胞各亚群与总T细胞之间无显著相关性。见图5。

图5 NKT细胞和传统T细胞与其各亚群之间的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between the proportions of NKT cell subsets and NKT cells，and between the proportions of T cell subsets and T cells

3 讨论

NKT细胞最初被定义为能够同时表达NK细胞和T细胞表面标志的一类特殊的T淋巴细胞亚群。随着研究的深入，人们发现在NKT细胞中有一小部分是不表达NK细胞标志的，所以Godfrey在定义NKT细胞时则用能够识别由CD1d分子提呈的糖脂类抗原来取代表达NK细胞表面标志［9］。现在已经明确虽然大部分NKT细胞表达NK细胞表面标志，如CD161、CD94等，但由于NKT细胞恒定表达TCR，而NK细胞则不表达TCR，再加上NK细胞来源于骨髓，所以NKT细胞与NK细胞是截然不同的两群细胞。

NKT细胞是传统T细胞的一类特殊亚群，这两群细胞间又存在怎样的区别和联系呢？研究表明NKT细胞与传统T细胞间主要区别在于NKT细胞只能识别由CD1d分子提呈的糖脂类抗原，而非传统T细胞所识别的由MHCⅠ类或Ⅱ类分子提呈的蛋白质类抗原［3］；此外，活化后的NKT细胞可以迅速分泌IFN－γ、IL－4、IL－17等细胞因子，从而发挥重要的调节功能［4－6］，是一类重要的固有免疫应答细胞。

NKT细胞与传统T细胞在发育器官、亚群分类、体内分布等方面也存在某种联系，如NKT细胞通常被认为来源于胸腺［7］，也可根据CD4和CD8分子的表达情况进行分类，这些和传统T细胞完全相同。为了更清楚地认识人体外周血中的NKT细胞与传统T细胞间是否存在某些联系，本研究利用多色流式细胞术对正常人外周血中的NKT细胞和传统T细胞的含量及其各亚群所占比例进行了检测和分析。结果显示NKT细胞在正常人外周血淋巴细胞中所占比例较小，为0.35%（0.1%～1.5%），这一结果与李子涛等［10］的检测结果相符，而CD3＋T细胞比例则为58.4%（43.2%～72.5%），经Pearson相关性分析发现两群细胞含量无显著相关性（图1）。在对两群细胞中CD4亚群、CD8亚群、双阴性亚群比例检测时发现，在Va24＋NKT细胞中CD4亚群所占比例为69.1%（21.3%～90.9%）、CD8亚群为15.0%（4.5%～76.2%）、双阴性亚群为9.5%（0.7%～69.4%），CD4与CD8比值为4.725（0.28～14.90）；而在CD3＋T细胞中CD4亚群所占比例为54.7%（27.0%～74.7%）、CD8亚群为33.7%（19.9%～48.2%）、双阴性亚群为10.2%（1.9%～24.4%），CD4与CD8比值为1.6（0.59～3.75），检测结果与其它报道相符［10－11］。这些数据表明在NKT细胞群体中CD4亚群占优势，平均达69.1%，大约是CD8亚群的4.725倍，但个体差异很大。在我们检测的30例正常人样本中，发现有3例样本的NKT细胞CD8亚群的比例高达61.8%、76.2%和72.8%（图2），说明在大多数正常人外周血NKT细胞中以CD4亚群为主，但由于个体差异较大，不排除在个别正常人NKT细胞中则以CD8亚群为主；而在传统T细胞群体中CD4亚群所占比例略大于CD8亚群比例，比值大约为1.6倍，且个体间差异远不及NKT细胞（图4）。相关性分析显示两群细胞中CD4亚群比例显著相关，但由于CD8亚群不相关，所以CD4与CD8比值无显著相关性（图2～4）。研究中还发现初始NKT细胞与初始传统T细胞之间呈显著正相关（图2、3）。在对NKT细胞群体进行相关性分析时发现，CD4亚群NKT细胞比例与总NKT细胞含量之间呈显著负相关，这一结果与其它报道的结果完全相符［11－12］。同样方法分析了传统T细胞，结果显示传统T细胞各亚群与总T细胞之间无显著相关（图5）。

综上所述，本实验运用多色流式细胞术对NKT细胞和传统T细胞及各自亚群在正常人外周血中的分布规律进行了检测和分析，详细地描述了各细胞群体间的相互关系，即正常人外周血中TCRVα24＋NKT细胞与传统T细胞间除在CD4亚群和CD45RA初始细胞亚群间有显著相关外，其余各亚群相关较少，更进一步验证了NKT细胞与传统T细胞之间差异较大，是一群特殊的T细胞群体。造成这种差异的原因与NKT细胞的发育过程密切相关，研究表明虽然NKT细胞和传统T细胞都是在胸腺内发育成熟，也同样经历了阳性选择和阴性选择的发育过程，但是NKT细胞在胸腺内分化发育的模式、选择性抗原的种类以及调控机制等都有别于传统T细胞。NKT细胞在肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫和抗感染免疫方面发挥的作用越来越受到人们重视，深入了解该细胞的各种特性将有利于将该群细胞尽早应用于临床。

有趣的是在初始细胞亚群上两群细胞间也表现出了显著正相关，即正常人外周血中初始NKT细胞越多，则相应的传统初始T细胞也越多。NKT细胞是一群固有免疫细胞，除了在固有免疫应答阶段发挥重要作用以外，还可以连接固有免疫和适应性免疫；传统T细胞是适应性免疫细胞，介导适应性免疫应答［13］。固有免疫和适应性免疫是相辅相成、密不可分的。固有免疫是适应性免疫的先决条件和启动因素，适应性免疫的效应分子也可大大促进固有免疫应答的发生。我们判断固有免疫和适应性免疫之间的这种关系可能是造成初始NKT细胞和传统初始T细胞间显著相关的主要原因，所以我们推测记忆型NKT细胞与记忆型传统T细胞之间也可能存在某种相关性，有待进一步研究。

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（2014－09－17 收稿）

Correlation of TCRVα24＋NKT Cells and Conventional T Cells in the Peripheral Blood of Normal Persons:A Multi－color Flow Cytometry Analysis

Yao Chunyan1，Jiang Lina2，Wang Hongtao1et al
1Department of Immunology，Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity，
2Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Bengbu 233000，China

ObjectiveTo examine the correlation between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in terms of their frequency and proportion of subsets in peripheral bloods of normal persons.Methods Five－color fluorescence staining and flow cytometry were used to detect the frequency of TCRVα24＋NKT cells and conventional CD3＋T cells in the peripheral blood of normal persons（n＝30），and the proportions of CD4＋，CD8＋，double negative and CD45RA＋subset in NKT cells and conventional CD3＋T cells were measured as well.The difference and correlation between NKT cells and conventional CD3＋T cells were analyzed by using the statistical software.Results The frequency of NKT cells was 0.35%（0.10%－1.50%）and that of conventional T cells was 58.4%（43.2%－72.5%）.The proportions of CD4＋，CD8＋，double negative and CD45RA＋subset in NKT cells were 69.1%（21.3%－90.9%），15.0%（4.5%－76.2%），9.5%（0.7%－69.4%）and 32.4%（6.8%－54.0%），respectively，and those of each subset in conventional CD3＋T cells were 54.7%（27.0%－74.7%），33.7%（19.9%－48.2%），10.2%（1.9%－24.4%）and 39.8%（10.3%－63.0%），respectively.No correlations were found between TCRVα24＋NKT cells and conventional CD3＋T cells except CD4and CD45RA subsets between the two cells（r＝0.435 5，P＜0.05；r＝0.829 5，P＜0.01）.There was an inverse correlation between the frequency of total NKT cells and the percentage of CD4＋NKT cells，while a positive correlation was noted between the frequency of NKT cells and the percentage of CD8＋NKT cells（r＝－0.680 2，P＜0.01；r＝0.401 7，P＜0.05）.Conclusion There was little correlation between TCRVα24＋NKT cells and conventional T cells in peripheral bloods of normal persons except CD4＋and CD45RA＋subsets.

flow cytometry； NKT cell； correlation

R737.9

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.015

＊安徽省教育厅自然科学研究项目（No.KJ2011Z253）

姚春艳，女，1978年生，副教授，医学硕士，E－mail:yaochunyan051＠126.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:bb＿bqli＠163.com