CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18在NSCLC组织中的表达及意义

段楚骁， 付圣灵， 付向宁

CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18在NSCLC组织中的表达及意义

段楚骁， 付圣灵△， 付向宁

华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科，武汉 430030

目的 检测细胞角蛋白5／6（cytokeratin5／6，CK5／6）、P63蛋白、甲状腺转录因子－1（thyroid transcription factor－1，TTF－1）和细胞角蛋白8／18（cytokeratin8／18，CK8／18）在人非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）中的表达情况，研究其表达对于肺鳞癌和肺腺癌的诊断和鉴别诊断价值，探讨其临床意义。方法 采用免疫组化（EnVision法）检测CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18在1 067例病理确诊的NSCLC中的表达情况，分析其表达与NSCLC临床及病理资料的相关性。结果 CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18在NSCLC中的阳性表达率分别为50.2%（227／452）、59.6%（164／275）、61.6%（257／417）和94.3%（116／123）。CK5／6诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度分别为96.1%和89.8%，准确度为92.9%。P63诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度分别为97.0%和73.9%，准确度为86.1%。TTF－1诊断肺腺癌的灵敏度和特异度分别为88.1%和91.7%，准确度为89.2%。CK8／18诊断肺腺癌的灵敏度和特异度分别为100.0%和13.5%，准确度为70.9%。CK5／6和P63共同表达阳性诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度为84.1%和94.5%，准确度为89.0%。TTF－1和CK8／18共同表达阳性诊断肺腺癌的灵敏度和特异度为86.5%和100.0%，准确度为90.7%。CK5／6、P63主要表达在肺鳞癌，在男性、吸烟患者中升高明显（P＜0.05）；TTF－1、CK8／18主要表达在肺腺癌，TTF－1在女性、不吸烟患者中升高明显（P＜0.01）。NCSLC患者T分期越晚，其CK5／6、P63、TTF－1的阳性表达率越高（P＜0.01）。NSCLC患者淋巴结转移N分期越早，其CK5／6、P63的阳性表达率越高（P＜0.01）。P63的表达与肿瘤TNM分期呈负相关（P＜0.05）。结论 单个指标中CK5／6、TTF－1的阳性表达对于肺鳞癌、肺腺癌的鉴别诊断具有较高价值。CK5／6和P63，TTF－1和CK8／18联合诊断有利于提高诊断的特异性。NSCLC中CK5／6、P63和TTF－1的表达与肿瘤生长浸润程度呈正相关，CK5／6、P63的阳性表达程度与淋巴结转移分期呈负相关，P63的表达与肿瘤TNM分期呈负相关。

非小细胞肺癌； 免疫组织化学； CK5／6； P63； TTF－1； CK8／18

肺癌为临床上常见的恶性肿瘤，其发病率与死亡率一直居高不下。肺癌的个体化治疗逐步成为临床上治疗肺癌的主流趋势，明确的病理分型为其所有诊疗计划开展的前提。高分化的鳞癌和腺癌标本鉴别诊断并不困难，而低分化鳞癌和腺癌的鉴别诊断有时困难，特别在CT引导下经皮肺穿刺、经纤维支气管镜针吸活检术（TBNA）或超声支气管镜引导下经支气管针吸活检术（EBUS－TBNA）检查中，由于标本取材少、组织挤压、细胞坏死或其他原因导致诊断困难，因此借助于分子标志物区分肺鳞癌和肺腺癌为合理的选择。本研究通过免疫组化的方法，观察角蛋白5／6（cytokeratin5／6，CK5／6）、P63蛋白、甲状腺转录因子－1（thyroid transcription factor－1，TTF－1）和细胞角蛋白8／18（cytokeratin8／18，CK8／18）在1 067例非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）患者组织中的表达情况，发现CK5／6、TTF－1的阳性表达对于肺鳞癌、腺癌的鉴别诊断已具有较高价值，且CK5／6和P63，TTF－1和CK8／18联合诊断可以进一步提高诊断的特异度。

1 材料与方法

1.1 材料

收集我院胸外科手术切除存档的原发性NSCLC组织标本1 067例。所有病理切片均采用苏木精－伊红（HE）染色，确诊为原发性NSCLC。收集与病例相关的临床病理资料。

1.2 试剂与方法

主要试剂为鼠抗人CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18单克隆抗体，严格采用免疫组化EnVision两步法进行染色（抗体、EnVision两步法试剂盒均为丹麦DAKO公司产品）。所有组织标本经10%中性甲醛液固定，常规脱水以后经石蜡包埋，连续切片5～6张，每张切片厚约5μm，取其中1张行HE染色，用于核实病理学诊断，剩余切片用于免疫组化染色。

1.3 结果判定

免疫组化切片由本院2位经验丰富的病理科医生阅片审核。CK5／6、CK8／18阳性表达定位于细胞膜和细胞质，P63、TTF－1均定位于细胞核。当肿瘤细胞阳性表达小于10%且没有局灶区域呈阳性表达时记为阴性；当肿瘤细胞阳性表达大于10%时记为阳性；当标本细胞几乎全部表达阴性但局灶区域呈强阳性表达时记为局灶阳性，本研究中局灶阳性记为阳性范畴［1］。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计数资料组间比较采用卡方检验，计量资料组间均数比较采用t检验，数据间相关分析采用Pearson相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理资料

1 067例NSCLC患者中男性789例，女性278例，中位年龄58岁（26～86岁）。其中鳞癌426例（39.9%），腺癌602例（56.4%），大细胞癌21例，肺肉瘤样癌18例；吸烟者689例（64.6%）。肿瘤分期中0期3例，Ⅰ期300例，Ⅱ期217例，Ⅲ期489例，Ⅳ期28例（部分患者因手术目的为病理活检等原因，未行肺癌根治术，病理分期未定）。

2.2 单个指标在诊断和鉴别诊断肺癌中的价值

CK5／6阳性颗粒定位于细胞膜和细胞质，P63蛋白阳性颗粒定位于细胞核，在NSCLC组织中总体阳性表达率分别为50.2%和59.6%，均主要表达在肺鳞癌，明显高于肺腺癌、肺肉瘤样癌和肺大细胞癌（P＜0.05）。在鳞癌和腺癌的鉴别诊断中，CK5／6诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度分别为96.1%和89.8%，准确度为92.9%。P63诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度分别为97.0%和73.9%，准确度为86.1%。见表1、2。

TTF－1蛋白阳性颗粒定位于细胞核，CK8／18阳性颗粒定位于细胞膜和细胞质，在NSCLC组织中总体阳性表达为61.6%和94.3%，主要表达在肺腺癌，明显高于肺鳞癌、肺肉瘤样癌和肺大细胞癌（均P＜0.05）。在鳞癌和腺癌的鉴别诊断中，TTF－1诊断腺癌的灵敏度和特异度分别为88.1%和91.7%，准确度为89.2%。CK8／18诊断腺癌的灵敏度和特异度分别为100.0%和13.5%，准确度为70.9%。见表1、2。

2.3 联合检测在诊断和鉴别诊断肺癌中的价值

CK5／6和P63共同表达阳性诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度为84.1%和94.5%，准确度为89.0%。TTF－1和CK8／18共同表达阳性诊断肺腺癌的灵敏度和特异度为86.5%和100.0%，准确度为90.7%。在单个指标区分肺鳞癌和肺腺癌的价值中，CK5／6、TTF－1的阳性表达均具有较高的灵敏度和特异度。CK5／6和P63共同表达阳性、TTF－1和CK8／18共同表达阳性对肺鳞癌和腺癌的鉴别诊断均具有较高的特异度，但灵敏度稍低。见表2。

表1 CK5／6、P63、TTF－1、CK8／18在NSCLC中的表达Table 1 The expressions of CK5／6，P63，TTF－1and CK8／18in NSCLC

表2 单个或联合免疫组化标志物在肺鳞癌和肺腺癌鉴别诊断中的灵敏度、特异度、阳性和阴性预测值、准确度Table 2 The sensitivity，specificity，positive predictive value，negative predictive value and accuracy of the single immunohistochemical indicator or combined indicators in the differential diagnosis of lung SCC and ADC

2.4 CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18的阳性表达与NSCLC临床病理的关系

CK5／6、P63阳性表达在吸烟、男性患者中增高明显（P＜0.05）。CK5／6、P63阳性表达在肿瘤不同T分期中具有显著性差异（P＜0.05），在肿瘤体积更大或临近组织受累范围更大时表达显著升高。CK5／6、P63阳性表达与淋巴结转移情况呈明显负相关（P＜0.05），即淋巴结转移N分期越晚，CK5／6、P63阳性表达越低。P63的阳性表达在不同的肿瘤TNM分期中具有显著性差异，肿瘤分期越早，P63阳性表达越高（P＜0.05）。TTF－1在女性、不吸烟患者中阳性表达明显增高（P＜0.01）。TTF－1在腺癌不同分化程度及肿瘤生长情况中阳性表达具有显著性差异，腺癌分化程度越高或肿瘤T分期越早，TTF－1阳性表达越高（P＜0.01），与淋巴结转移情况及肿瘤TNM分期无关。见表3。

3 讨论

细胞角蛋白CK主要分布于上皮细胞，是细胞的主要骨架蛋白，它包括1、2两种类型。CK具有较高的保守性和组织分化特异性，任何一种上皮细胞至少表达一种1型CK和一种2型CK。CK5／6主要表达于鳞状上皮细胞或鳞癌细胞的细胞膜和细胞质，在腺上皮细胞中几乎不表达，对于鳞癌和腺癌有很好的鉴别诊断作用。本研究中CK5／6诊断肺鳞癌的灵敏度和特异度分别为96.1%和89.8%。国外报道中CK5／6对于肺鳞癌诊断的灵敏度为75%～100%，本研究与之相符［12］。CK8／18在鳞癌、腺癌中均有阳性表达，其诊断腺癌的灵敏度虽高达100.0%，即所有肺腺癌组织中均表达CK8／18，但由于其在肺鳞癌组织中同样存在高表达，故特异度较低，准确度仅为70.9%。CK5／6阳性表达在吸烟、男性患者中增高明显（P＜0.01），恰好与鳞癌的好发人群有一定关系。CK5／6的阳性表达在肿瘤体积更大或临近组织受累范围更大时表达显著升高，而在淋巴结转移程度越高时阳性表达越低，说明CK5／6可能与肿瘤生长浸润及淋巴结转移中的某些环节关系密切，具体机制有待进一步实验研究。

表3 CK5／6、P63、TTF－1、CK8／18在NSCLC中的表达及与临床、TNM分期的关系Table 3 The relationships between the expressions of CK5／6，P63，TTF－1and CK8／18and clinical features or TNM staging in NSCLC

P63常表达于上皮组织基底层，在正常上皮组织的形成中发挥重要作用［3］。P63在鳞状细胞源性的各种良恶性肿瘤组织中有着表达，尤其在鳞癌组织中表达增强，且表达频率及分布与鳞癌细胞间变程度显著相关［4］。在正常肺组织中，P63蛋白表达于支气管储备细胞中，不表达于肺泡上皮细胞、纤毛细胞或非上皮细胞。国内外有较多研究P63的文献报道，P63是国外研究肺鳞癌时的常用指标。在Wang等［5］的研究中显示P63对肺鳞癌的诊断灵敏度达100%，而不出现在小细胞肺癌和癌肉瘤中。周春辉等［6］研究中同样显示P63在肺鳞癌组织中的阳性率达100%，而在其他组织类型的肺癌中表达率低，他们由此认为P63可作为鳞状上皮源性肿瘤的标志物。Pelosi等［7］研究显示118例鳞癌中有109例表达P63，同时95例肺腺癌中15例表达P63蛋白。Warth等［8］的大样本研究中显示P63对肺鳞癌的诊断敏感度为93.6%，但准确度为78.2%。在本研究中发现其对鳞癌诊断的灵敏度和特异度分别为97.0%和73.9%，其准确度为86.1%。本研究显示P63阳性表达在吸烟、男性患者中增高明显（P＜0.05），与肿瘤T分期呈正相关（P＜0.05），与肿瘤N分期呈负相关（P＜0.01）。在不同的肿瘤TNM分期中，P63阳性表达具有显著性差异，肿瘤分期越晚，P63阳性表达越少（P＜0.05）。P63与肿瘤的发生发展关系密切，对患者预后有提示作用。有学者推测P63的表达可能与某种程度的鳞状上皮相关性基因的表达潜能有关［9］。

TTF－1又称甲状腺特异性增强子结合蛋白，是一种在甲状腺、肺和间脑早期发育过程中表达的组织特异性转录因子。在NSCLC中，TTF－1主要表达于肺腺癌和小细胞癌中，在肺鳞癌中几乎没有表达［1，10］。本研究显示TTF－1诊断腺癌的灵敏度和特异度分别为88.1%和91.7%。国内王红梅等［11］的研究显示TTF－1在肺腺癌中的阳性表达率为84.6%，而在肺鳞癌中仅为5%。Mukhopadhyay等［1］的研究中TTF－1在20例腺癌中有16例表达为阳性，阳性率达80%，而15例鳞癌患者组织中无一例表达，特异度为89%。Sterlacci等［12］的研究显示206例肺腺癌患者组织中172例TTF－1阳性表达，阳性表达率为83.5%，另外少部分在肺鳞癌（4／117），大细胞肺癌（5／22）中表达。Thunnissen等［13］研究110例NSCLC患者中TTF－1检测腺癌的敏感度和特异度分别是76.2%和73.8%。Warth等［8］研究的530例腺癌患者中的TTF－1灵敏度为87.7%，特异度为85.6%。Terry等［14］对243例腺癌的研究结果显示TTF－1对腺癌检测的灵敏度和特异性分别为62%和92%。由于TTF－1的组织特异性表达，近年来它被用作原发性及转移性肺癌的鉴别诊断标志物，以明确转移性腺癌是否具有肺源性［15］。本研究显示TTF－1在女性、不吸烟患者中表达明显（P＜0.01），而不吸烟女性是肺腺癌的好发人群。TTF－1在腺癌不同分化程度及肿瘤生长情况中阳性表达具有显著性差异，腺癌分化程度越高或肿瘤T分期越早，TTF－1阳性表达越高，提示TTF－1在肿瘤的发生发展中可能有着重要作用。

本研究结果显示以上4个指标在单独鉴别肺鳞癌和腺癌中，CK5／6和TTF－1已有较高的灵敏度和特异度，而P63和CK8／18灵敏度较高，特异度较低。CK5／6和P63的联合检测对肺鳞癌诊断的特异度较CK5／6的89.9%提高到94.6%，准确度保持在89.0%的较高水平。CK5／6的表达与P63的表达呈正相关。同样，TTF－1和CK8／18的联合检测对于腺癌的诊断，其特异度也明显提高，分别由原来的91.7%和13.5%提高到100.0%，其准确度保持在90.7%的较高水平。Terry等［14］对225例鳞癌和200例腺癌中9种免疫标志物（P63、TTF1、CK5／6、CK7、34βE12、napsin A、mucicarmine、神经营养性络氨酸激酶1受体和2受体）的表达进行检测，并作Logistic回归分析，显示CK5／6、CK7、P63、TTF－1、napsin A及mucicarmine这组免疫组化指标对于鳞癌和腺癌的鉴别诊断最有价值。但是本研究发现，只用CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18这4个指标，已经有很高的鉴别诊断价值。对于形态学难以确定的低分化癌或转移癌，可联合检测CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18行肺鳞癌和腺癌的诊断及鉴别诊断［16－18］。

在NSCLC中，鳞癌和腺癌的非手术治疗方案有很大差异，病理医师借助免疫组化标志物正确区分肿瘤类型，对于肿瘤患者治疗方案的确定以及预后情况的判断有很大影响。CK5／6、P63、TTF－1和CK8／18免疫标志物的测定，对NSCLC的生长情况及分期，也有一定的提示作用。

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（2014－05－09 收稿）

Expressions of CK5／6，P63，TTF－1 and CK8／18 in Non－small Lung Cancer Tissues and Their Clinical Significance

Duan Chuxiao，Fu Shengling△，Fu Xiangning
Department of Thoracic Surgery，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

ObjectiveTo investigate the expressions of CK5／6，P63，TTF－1and CK8／18in the non－small cell lung cancer（NSCLC）in order to evaluate their value in the differential diagnosis of primary lung squamous cell carcinoma（LSCC）and adenocarcinoma（LADC）and their clinical significance.Methods The expressions of CK5／6，P63，TTF－1and CK8／18were detected in pathologically confirmed NSCLC tissue specimens（n＝1 067）by immunohistochemical technique（EnVision two－step method）.The association of their expressions with clinical and pathological characteristics of NSCLC was analyzed.Results The positive rates of CK5／6，P63，TTF－1and CK8／18in NSCLC tissues were 50.2%（227／452），59.6%（164／275），61.6%（257／417）and 94.3%（116／123），respectively.The sensitivity，specificity and accuracy of CK5／6in the dignosis of LSCC were 96.1%，89.8%and 92.9%，respectively.Those of P63were 97.0%，73.9%and 86.1%，respectively.Those of TTF－1were 88.1%，91.7%and 89.2%，respectively.Those of CK8／18were 100.0%，13.5%and 70.9%，respectively.Those of both CK56and P63expressions were 84.1%，94.5%and 89.0%，respectively.Those of both expressions of TTF－1and CK8／18 were 86.5%，100.0%and 90.7%，respectively.CK5／6and P63frequently expressed in LSCC，and they were significantly increased in males and smokers.TTF－1and CK8／18predominantly expressed in ADC，especially in females and non－smokers.The positive expression rates of CK5／6，P63，and TTF－1were profoundly increased in NSCLC patients with late T stage（P＜0.01）.The later the N stage，the higher the positive expression rates of CK5／6and P63in NSCLC patients.The expression of P63was negatively associated with TNM stage of NSCLC（P＜0.01）.Conclusion For the single immunohistochemical indicator，CK5／6 and TTF－1have high sensitivity and specificity in the differential diagnosis of LSCC and LADC.Use of combined indicators，such as CK56and P63，TTF－1and CK8／18，significantly contributes to the differential diagnosis of LSCC and LADC.The expressions of CK5／6，P63and TTF－1are positively associated with invasion of NSCLC.The expressions of CK5／6and P63are negatively associated with lymphatic metastasis.P63expression is negatively associated with TNM stage of NSCLC.

non－small cell lung cancer； immunohistochemistry； CK5／6； P63； TTF－1； CK8／18

R734.2

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.005

段楚骁，男，1989年生，硕士研究生，E－mail:duanchuxiao＠163.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:t0102005＠126.com