大鼠pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒表达载体的构建与包装＊

席 进， 陈月娟， 张 楠， 张敬星， 胡建国， 吕合作

大鼠pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒表达载体的构建与包装＊

席 进， 陈月娟， 张 楠， 张敬星， 胡建国， 吕合作△

蚌埠医学院科研中心组织移植安徽省重点实验室，蚌埠 233030

目的 构建大鼠少突胶质细胞转录因子1（Olig1）的慢病毒表达载体，并进行鉴定和包装。方法 采用聚合酶链反应（PCR），分别以大鼠pEGFP－N3－Olig1表达质粒和pDsRed－monomer－N1为模板，扩增获得大鼠Olig1片段和红色荧光蛋白（RFP）片段。将两者进行PCR拼接获得Olig1－RFP片段，并与pLenti6.3－MCS－DEST载体连接，构建获得pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒表达载体，并进行酶切鉴定、测序。然后，将其与包装质粒混合后共转染HEK293T细胞进行包装获得慢病毒颗粒。结果 通过酶切鉴定、测序，证明pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒表达载体构建成功，且能够被高效地包装为病毒颗粒。结论 成功建立大鼠pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒表达系统，为进一步研究Olig1的生物学作用提供了实验基础。

少突胶质细胞转录因子1； 慢病毒表达载体； 包装； 聚合酶链反应； 大鼠

少突胶质细胞转录因子1（oligodendrocyte transcription factor 1，Olig1）属于碱性螺旋－环－螺旋（basic－helix－loop－helix，bHLH）转录因子超家族，是近年来备受关注的一个转录因子，与少突胶质细胞的分化和成熟有关，在神经胶质细胞分化发育过程中发挥重要的调节作用［1］。在前期的研究中，我们构建了pEGFP－N3－Olig1真核表达载体，并转染体外扩增培养的大鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells，NSCs），观察其对NSCs分化的影响，结果表明Olig1过表达不仅能够促进NSCs向少突胶质细胞方向分化，而且也能够促进分化细胞的成熟，这为下一步细胞移植治疗脱髓鞘疾病的研究提供了重要依据［2］。但是，pEGFP－N3－Olig1真核表达载体存在着转染效率偏低的缺点，不利于进一步的研究应用。因此，在本研究中我们拟采用慢病毒载体构建转染效率高的Olig1表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料

Olig1真核表达载体pEGFP－N3－Olig1、包装细胞HEK293T和DH5α感受态细胞均由本室保存。限制性内切酶BamHⅠ、NheⅠ和T4DNA连接酶购自NEB公司。pDsRed－monomer－N1购自Clontech公司。慢病毒表达载体pLenti6.3－MCSDEST、platinum pfx DNA聚合酶购自Invitrogen公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.2 pLenti 6.3－Oligl－RFP慢病毒载体构建

设计目的基因Olig1与RFP进行PCR拼接的PCR引物。引物序列见表1（红色为酶切位点序列，绿色为kozak序列，黄色为PCR拼接引物重叠区序列）。以pEGFP－N3－Olig1为模板，引物Olig1－RFPBamHⅠ－P1和Olig1－RFP－P2扩增目的基因拼接片段；同时以pDsRed－monomer－N1为模板，引物Olig1－RFP－P3和Olig1－RFP－NheⅠ－P4扩增RFP拼接片段。循环条件为:95℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，68℃延伸1min，共30个循环，最后于68℃延伸10min。PCR产物电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收Olig1和RFP片段。用引物Olig1－RFP－BamHⅠ－P1和Olig1－RFP－NheⅠ－P4将回收的PCR产物进行PCR拼接，得到Olig1－RFP片段，循环条件为:95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸2min，共30个循环，最后于68℃延伸10min。PCR产物电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收Olig1－RFP片段。用BamHⅠ和NheⅠ对Olig1－RFP片段和pLenti6.3－MCSDEST同时进行酶切。电泳，并回收酶切后的Olig1－RFP片段和pLenti6.3－MCS－DEST。将酶切后的目的基因与载体经T4DNA连接酶于4℃连接过夜，并转化DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆经摇菌后提取质粒，以BamHⅠ和NheⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定符合的克隆送上海博亚公司进一步测序鉴定。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of the primers used for PCR

1.3 pLenti 6.3－Olig1－RFP慢病毒的包装和浓缩

取处于对数生长期细胞状态良好的HEK293T细胞，计数后，按照6×106每10cm培养皿的浓度接种于含15%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中。于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。取包装试剂（packaging mix，Invitrogen公司）9μg和重组慢病毒质粒3μg加入1.5mL 37℃预热的Opti－MEM培养液中，另取1.5mL Opti－MEM培养液加入36μL Lipofectamine 2000中，轻轻混匀，置室温5min。轻轻混合质粒和Lipofectamine 2000稀释液，置室温20min。用Opti－MEM洗培养皿中的细胞2遍，加入5mL Opti－MEM。将3mL脂质体和质粒的混合物小心地加入细胞培养皿中，轻轻混匀，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育6h，更换完全培养液。48h后收集细胞培养上清，3 000r／min离心5 min，取上清，用0.45μm的滤器过滤后即为包装的病毒液。然后对病毒液进行25 000r／min离心2 h，取沉淀用含2%FBS的细胞培养液重悬至400 μL，4℃溶解过夜后分装，置于－80℃冰箱保存。同时取部分样品做梯度稀释进行病毒滴度测定。

1.4 慢病毒滴度测定

第1天，将对数生长期的HEK293T细胞胰酶消化计数后，按照每孔8 000细胞接种于96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞可长至30%～50%的融合度。第2天，将保存于－80℃冰箱中病毒液冰水浴融化，用含8μg／mL polybrene和2%FBS的DMEM培养液进行梯度稀释:1号稀释液为5μL病毒液＋245μL病毒稀释用培养液，2号稀释液为25μL 1号稀释液＋225μL病毒稀释用培养液，3号稀释液为25μL 2号稀释液＋225μL病毒稀释用培养液，4号稀释液为25μL 3号稀释液＋225μL病毒稀释用培养液，5号稀释液为25μL 4号稀释液＋225μL病毒稀释用培养液，6号稀释液为25μL 5号稀释液＋225μL病毒稀释用培养液。小心吸去96孔板中的培养液，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100μL加入每孔细胞中，每个稀释度3个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养。第3天，去除含慢病毒的培养液，加入100μL的完全培养液。第5、6天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

2 结果

2.1 Olig1和RFP基因的PCR扩增和拼接

分别以pEGFP－N3－Olig1和pDsRed－monomer－N1质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在预期的位置分别出现1条约735 bp（Olig1）和678bp（RFP）的条带（图1）。经PCR拼接后的产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在预期的位置出现1条约1 413bp的条带（Olig1－RFP片段）（图2）。

图1 Olig1和RFP基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of Olig1and RFP gene

图2 Olig1和RFP基因拼接PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product put by Olig1and RFP gene

2.2 pLenti 6.3－Olig1－RFP慢病毒载体的构建和鉴定

经PCR拼接的Olig1－RFP片段经BamHⅠ和NheⅠ双酶切后，克隆到同样经BamHⅠ和NheⅠ双酶切的慢病毒载体pLenti6.3－MCS－DEST中。转化DH5α菌后筛选出对氨苄西林具有抗性的阳性克隆，小量制备质粒，用BamHⅠ和NheⅠ双酶切鉴定重组质粒，可切出约1 413bp和9 387bp的片段，同预期的长度均一致（图3）。测序结果经对比序列完全一致（图4），说明Olig1－RFP基因已成功克隆至pLenti6.3－MCS－DEST载体中。

2.3 慢病毒活性滴度测定

pLenti 6.3－Olig1－RFP慢病毒感染HEK293T细胞72h后，各孔的荧光照片如图5所示，表达红色荧光的细胞数量随着病毒稀释度的增大而减少（6号稀释液孔中已观察不到红色荧光细胞）。5号稀释液孔中观察到表达红色荧光的细胞分别为18个、22个和20个，则病毒的滴度为:（18＋22＋20）／3＝20.0TU，20.0TU／（2×10－7）mL＝1.0×108TU／mL。

图4 pLenti 6.3－Olig1－RFP慢病毒载体核酸序列分析结果Fig.4 The DNA sequencing results of pLenti6.3－Olig1－RFP lentiviral vector

图5 不同浓度pLenti 6.3－Olig1－RFP慢病毒感染HEK293T细胞的荧光图Fig.5 The fluorescent pictures of HEK293Tcells infected by different concentrations of pLenti 6.3－Olig1－RFP lentivirus

3 讨论

Olig基因包括Olig1、Olig2和Olig3基因，属于bHLH转录因子超家族。其中，Olig1和Olig2在神经系统发育过程中与少突胶质前体细胞的分化密切相关［3］。研究表明，Olig1和Olig2能够促进NSCs向少突胶质细胞分化，并且Olig1能够部分代偿Olig2的功能，促进少突胶质细胞的成熟［4－5］。这提示可以以Olig1分子为靶点，以控制NSCs的分化方向。

通过基因修饰的方法将目的基因过表达是目前研究某一基因功能的常用方法［6－7］。在前期的研究中，我们用电穿孔的方法转染Olig1真核表达载体给NSCs，结果发现只有20%的转染率［2］，这对于移植Olig1过表达的NSCs到体内以进一步观察其对神经细胞分化的影响是远远不够的。因此，为了提高转染效率，我们采用慢病毒载体pLenti6.3，同时给予RFP作为标志，以利于以后实验中过表达Olig1细胞的观察。结果表明通过PCR拼接和分子克隆技术，成功构建重组的pLenti6.3－Olig1－RFP慢病毒载体，限制性酶切和核酸测序均证明这种载体构建是正确的。而且，重组质粒pLenti6.3－Olig1－RFP与包装质粒混合物也能够有效地包装出高滴度的病毒颗粒，这为进一步在体内研究Olig1的生物学作用提供了实验基础。

［1］ Paes de Faria J，Kessaris N，Andrew P，et al.New Olig1null mice confirm a non－essential role for Olig1in oligodendrocyte development［J］.BMC Neurosci，2014，15:12.

［2］ 吕合作，邹健，王艳霞，等.Olig1过表达对大鼠神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响［J］.神经解剖学杂志，2010，26（2）: 201－205.

［3］ Zhou Q，Wang S，Anderson D J.Identification of a novel family of oligodendrocyte lineage－－specific basic helix－loop－helix transcription factors［J］.Neuron，2000，25（2）:331－343.

［4］ Fang F，Zhang H，Zhang Y，et al.Antipsychotics promote the differentiation of oligodendrocyte progenitor cells by regulating oligodendrocyte lineage transcription factors 1and 2［J］.Life Sci，2013，93（12－14）:429－434.

［5］ Meijer D H，Kane M F，Mehta S，et al.Separated at birth？The functional and molecular divergence of OLIG1and OLIG2［J］.Nat Rev Neurosci，2012，13（12）:819－831.

［6］ Li J，Luo J，Luo Y Q，et al.Overexpression of tumstatin in genetically modified megakaryocytes changes the proangiogenic effect of platelets［J］.Transfusion，2014，54（8）:2106－2117.

［7］ 刘星星，范恒，唐庆，等.CXCR4基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定［J］.华中科技大学学报:医学版，2014，43（1）:1－5.

（2014－10－16 收稿）

Construction and Package of Rat pLenti6.3－Olig1－RFP Lentiviral Expression Vector

Xi Jin，Chen Yuejuan，Zhang Nan et al
Anhui Key Laboratory of Tissue Transplantation，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China

ObjectiveTo construct，identify and package the lentiviral vector encoding rat oligodendrocyte transcription factor 1（Olig1）gene.Methods Rat Olig1and red fluorescent protein（RFP）genes were amplified from pEGFP－N3－Olig1eukaryotic expression plasmid and pDsRed－monomer－N1plasmid，respectively by polymerase chain reaction（PCR）.The Olig1and RFP genes were spliced by overlap extension PCR to obtain Olig1－RFP fragment.The gene fragment was then inserted into pLenti6.3－MCS－DEST to construct recombinant pLenti6.3－Olig1－RFP lentiviral vector.The recombinant vectors were identified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The lentiviral vector and package virus were co－transfected into HEK293T cells to obtain lentiviral particles.Results The restriction enzyme digestion and DNA sequencing results showed the pLenti6.3－Olig1－RFP vector was constructed successfully.The lentiviral vector could be efficiently packaged into virus particles.Conclusion The rat pLenti6.3－Olig1－RFP lentiviral vector is successfully constructed，which provides an experimental basis for further research on the biological effects of Olig1.

oligodendrocyte transcription factor 1； lentiviral expression vector； package； polymerase chain reaction；rat

R349.6

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.02.011

＊国家自然科学基金资助项目（No.81071268，81171465，81271363）席 进，男，1980年生，助理实验师，E－mail:xijin888＠tom.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:lhz233003bmc＠gmail.com