离心运动对青年男性外周血淋巴细胞凋亡的影响

苏 晨

（苏州大学体育学院，江苏 苏州 215021）

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离心运动对青年男性外周血淋巴细胞凋亡的影响

苏 晨

（苏州大学体育学院，江苏 苏州 215021）

20名青年男性（20～30岁）在电动跑台上分别进行坡度为0°的水平跑（向心运动）和坡度为-10°的下坡跑（离心运动），运动时间为30 min，强度为70%VO2max，两次运动间隔一周进行。分别在运动前、运动后0 h（运动后即刻）、2 h、24 h和48 h取静脉血测定肌酸激酶（CK）活性、外周血淋巴细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2含量，探讨离心运动造成的运动性肌肉损伤对外周血淋巴细胞凋亡的影响以及凋亡发生的可能机制。结果显示，水平跑时各指标在各时间点均无显著性变化（P＞0．05）。下坡跑时，肌酸激酶活性在运动后24 h升高（P＜0．01），48 h下降但仍高于运动前水平（P＜0．01）；淋巴细胞凋亡率在运动后0 h开始升高（P＜0．01）并一直持续至运动后48 h（P＜0．01）；Bax／Bcl-2比值在运动后24 h升高（P＜0．01），运动后48 h开始降低并高于运动前（P＜0．01）。以上结果表明:离心运动诱导的淋巴细胞凋亡可能是运动性肌肉损伤造成的，线粒体介导的凋亡通路起着关键作用。

离心运动；淋巴细胞凋亡；凋亡蛋白；肌酸激酶；运动性免疫抑制

运动可对机体的免疫系统产生深刻而复杂的影响。循环中免疫细胞的数量在大强度运动中升高，运动后则出现显著降低，继而发生运动性免疫抑制。运动性免疫抑制可导致免疫机能下降、感染性疾病的发病率明显升高，是运动员发生过度疲劳及相关运动性疾病的重要原因，也是影响运动员训练效果甚至运动寿命的关键因素［1］。运动后淋巴细胞减少可能是由于大强度运动诱导淋巴细胞凋亡造成的［2］。关于运动与免疫细胞凋亡的研究，主要集中在不同运动强度和运动时间对淋巴细胞凋亡的影响［3］。作者前期的研究证实，力竭运动可诱导外周血淋巴细胞凋亡［4］。离心运动与淋巴细胞凋亡关系的研究罕有报道。与向心运动比较，离心运动更易造成肌肉酸痛、损伤和疲劳，同时也是造成运动性免疫抑制的重要原因。因此，本研究的目的在于探讨离心运动（下坡跑）造成的运动性肌肉损伤对外周血淋巴细胞凋亡的影响，以及凋亡发生的可能机制。

1 研究对象与方法

1．1 研究对象

选取某大学体育学院体育系男子大学生20名，受试者身体健康，均无心血管疾病、糖尿病、慢性感染、骨骼肌肉病史及其他严重疾患病史、无常规用药史（包括营养补剂）、无烟酒嗜好。研究对象的一般特征见表1。实验前签订知情同意书，并且在实验前48 h内受试者均未进行过剧烈运动。

表1 研究对象的一般特征

受试者先测定最大摄氧量（maximal oxygen uptake，VO2max），3 d后在电动跑台上进行一次坡度为0°的水平跑（向心运动）。间隔一周后，再进行一次坡度为-10°的下坡跑（离心运动），两次运动的时间均为30 min，强度为70%VO2max。分别于运动前、运动后0 h（运动后即刻）、2 h、24 h和48 h取静脉血测定肌酸激酶活性、外周血淋巴细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2含量。

1．3 VO2max测定

受试者先进行10～15 min准备活动，然后佩带呼吸面罩和遥测心率表（Polar S810，芬兰），利用电动跑台和心肺测试系统（Cortex II，德国）进行递增负荷运动实验，起始负荷为8 km／h，每3 min递增2 km／h，直至力竭。运动过程中同步测定气体代谢指标，包括摄氧量（VO2）、CO2呼出量（VCO2）、呼吸商（RQ＝VCO2／VO2）等。VO2max的判断标准:1）VO2不随运动负荷的增加而上升或出现下降；2）RQ大于1．1；3）出现VO2平台；4）受试者达到力竭。符合以上标准中的3项即终止实验，此时的VO2即为VO2max。实验室环境:氧浓度21．0%，CO2浓度＜300 ppm，温度24℃，相对湿度40%～60%，气压760 mmHg。

1．4 跑台运动实验

运动前休息15 min，肘正中静脉取血5 mL。所有受试者佩戴遥测心率表（Polar S810，芬兰），进行10 min准备活动（慢跑和拉伸）后，在电动跑台上进行一次坡度为0°的水平跑，强度为70%VO2max对应性的心率，持续时间均为30 min。运动后即刻（0 h）、2 h、24 h和48 h取静脉血5 mL。间隔一周后，受试者再进行一次坡度为-10°的下坡跑（离心运动）运动，运动强度、持续时间、采血时间点以及血样处理同水平跑实验。

1．5 血样处理

5 mL全血经EDTA抗凝后分成两份，1 mL离心取血浆（4℃，3 000 r／min）测定肌酸激酶（creatine kinase，CK）活性，4 mL分离淋巴细胞测定淋巴细胞凋亡率以及促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2含量。

1．6 血浆CK活性测定

微课传入我国后已经获得了快速的发展，在互联网上有很多不同内容的微课资源，在高中化学的实际教学中，化学教师可以根据教学的需要，从网上下载微课进行教学，或者根据教学的实际需要对微课进行剪辑编辑.

血浆CK活性试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，批间与批内变异系数均＜8%。利用全自动生化仪（日立7180型，日本）以酶偶联比色法测定。严格按照试剂盒说明进行操作。单位:U／L。

1．7 淋巴细胞分离

取抗凝血，用Hank’s液等倍稀释后，加入等体积的淋巴细胞分离液（上海亿欣生物科技有限公司），2 000 r／min离心20 min，吸去上层血浆，小心收集淋巴细胞层，Hank’s液洗涤后500 r／min离心10 min，弃上清。

1．8 淋巴细胞凋亡率测定

使用预冷的PBS制备淋巴细胞悬液，用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106cells／mL，加入0．8 mL含RNase的碘化丙啶，4℃避光20 min，加入400μL PBS混匀。用流式细胞仪（FACS 420，美国Becton Dickinson公司）检测淋巴细胞凋亡率，单位:%。

1．9 Bax和Bcl-2蛋白含量测定

使用蛋白提取试剂盒（南京建成生物工程研究所）提取淋巴细胞总蛋白，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定淋巴细胞Bax和Bcl-2蛋白含量，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明进行操作，批间与批内变异系数＜7．5%。单位:pg／mL。

1．10 统计学处理

所有数据用“均数±标准差”表示，利用SPSS 15．0 for Windows统计软件进行数据分析。同一实验不同时间点各指标的比较用重复测量的因素方差（repeated ANOVA）分析，两次实验同一时间点比较用配对t-检验。P＝0．05定为显著性水平，P＝0．01定为非常显著水平。

2 结果

2．1 离心运动对青年男性外周血血浆CK活性的影响

水平跑时，血浆CK活性在各时间点均无显著性变化（P＞0．05）。下坡跑时，血浆CK活性在运动后24 h升高（P＜0．01），48 h下降但仍高于运动前水平（P＜0．01），见图1。

2．2 离心运动对青年男性外周血淋巴细胞凋亡率的影响

水平跑时，外周血淋巴细胞凋亡率在各时间点均无显著性变化（P＞0．05）。下坡跑时，外周血淋巴细胞凋亡率在运动后0 h开始升高（P＜0．01）并一直持续至运动后48 h（P＜0．01），见图2。

图1 血浆CK活性的时程变化

图2 外周血淋巴细胞凋亡率的时程变化

2．3 离心运动对青年男性外周血淋巴细胞中Bax／Bcl-2比值的影响

水平跑时，Bax／Bcl-2比值在各时间点均无显著性变化（P＞0．05）。下坡跑时，Bax／Bcl-2比值在运动后24 h升高（P＜0．01），运动后48 h开始降低并高于运动前（P＜0．01），见图3。

3 讨论

高强度或力竭运动可导致肌肉损伤、氧自由基增多、DNA损伤，血清CK、皮质醇以及儿茶酚胺等应激激素增高。研究证实，上述因素均可作为启动因素，造成细胞程序性死亡（即凋亡）［5］。大强度运动后淋巴细胞减少可导致运动性免疫抑制，其机制可能与细胞凋亡有关。有关运动与免疫细胞凋亡关系的研究主要集中在运动强度和运动时间对淋巴细胞凋亡的影响。研究证实，高强度（＞75%VO2max）或力竭运动可造成免疫细胞凋亡增加以及DNA损伤［4］，而中等强度运动（65%～70%VO2max）对凋亡的影响仍有争议［6］。中等强度离心运动如下坡跑可造成肌肉损伤和延迟性肌肉酸痛［7］，但其对淋巴细胞凋亡的作用尚不得而知。与向心运动比较，肌肉反复的离心收缩可造成更为严重的细胞损伤，由于肌肉损伤后发生继发性肌纤维降解，因此损伤可持续2～3 d。CK是肌肉损伤的标志物，在本研究中，CK活性在离心运动后24 h达峰值，48 h开始下降，但仍高于运动前水平。Malm等［8］发现，-8°下坡跑时，CK活性在运动后24～48 h升高，而-4°下坡跑时CK活性在各时间点均无显著性变化。下坡跑诱导的肌肉损伤与下肢制动力引起的机械应激有关。

图3 Bax/Bcl-2比值的时程变化

离心运动后，受损的肌肉释放炎症因子和自由基入血，造成巨噬细胞氧化损伤和炎症反应，引起肌纤维继发性降解，从而加重最初的机械性应激损伤。研究表明，自由基可造成脂质过氧化，DNA和蛋白质氧化损伤，引起促凋亡／抗凋亡蛋白表达失衡，从而破坏线粒体膜电位和DNA结构，启动凋亡［9］。因此，运动性肌肉损伤可直接或间接引发循环中免疫细胞凋亡。细胞凋亡的发生主要依赖线粒体介导的信号通路［10］，起关键作用的是线粒体内的Bcl-2超家族蛋白［11］。DNA损伤或细胞内外应激启动了胞浆信号级联反应，导致p53磷酸化，进而上调Bax并下调Bcl-2表达［12］。Bax上调可促进凋亡，而Bcl-2升高则保护细胞免受氧化应激损伤从而抑制凋亡。研究发现，过表达Bcl-2可增加细胞内还原型谷胱甘肽［13］，后者的主要作用是清除自由基，相反，下调Bcl-2表达则可使谷胱甘肽含量显著降低。Bcl-2和Bax通过感应氧化-还原状态的改变进而调控凋亡［12］。Simon等［14］指出，单纯观察Bax或Bcl-2的变化是不全面的，并提出Bax／Bcl-2比值是决定细胞凋亡或存活的关键因素。本研究中，运动后24 h和48 h，CK活性和Bax／Bcl-2比值同步升高，提示淋巴细胞凋亡可能是运动性肌肉损伤造成的，线粒体介导的凋亡通路起着关键作用。

此外，本研究中Bax／Bcl-2比值在运动后即刻和运动后2 h并无显著性变化，提示存在其他因素介导了淋巴细胞的早期凋亡。研究表明，运动后即刻血中儿茶酚胺和皮质醇显著升高，两者均可诱导细胞凋亡［15］。因此推测本研究中淋巴细胞的早期凋亡可能与运动后应激激素的大量分泌有关。

4 结论

离心运动较向心运动更易造成肌肉损伤、氧化应激和细胞凋亡；离心运动诱导的肌肉损伤可能是淋巴细胞凋亡的重要原因，其机制与线粒体介导的凋亡途径激活有关。

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责任编辑:郭长寿

Effects of Eccentric Exercise on Apoptosis of Peripheral Blood Lymphocyte in Young M ales

SU Chen
（College of Physical Education，Suzhou University，Suzhou 215021，Jiangsu，China）

Twenty males（20～30 years old）performed a bout of level running（0°）and downhill running（-10°）test at 70%VO2maxand lasted for 30 m in on a treadm ill at one week interval．Blood sampleswere taken at pre-exercise and 0 h（immediately post），2，24，and 48 h after running and creatine kinase，peripheral blood lymphocyte apoptosis rate，pro-／anti-apoptotic proteins including Bax and Bcl-2 weremeasured to determine the effect of eccentric exercise induced muscle damage on the induction of apoptosis in peripheral blood lymphocyte and to investigate the possiblemechanism．The results showed that，all indices of subjects on level running had no significantly difference at each time point（P＞0．05）．When downhill running，creatine kinase activity was significantly elevated at 24 and 48 h after running（P＜0．01）．Peripheral blood lymphocyte apoptosis rate was significantly elevated at0 h and 2 h，and up to 48 h follow ing running（P＜0．01）．Bax／Bcl-2 ratio raised at24 h and 48 h post（P＜0．01）．Data above indicated that exercise-induced muscle damagemay contribute to an increase in peripheral blood lymphocyte apoptosis via apoptotic proteins in them itochondrial pathway．

eccentric exercise；lymphocyte apoptosis；apoptosis protein；creatine kinase；exercise-induced immunosuppression

G804．2

A

1004-0560（2015）04-0098-04

2015-06-12

2015-06-27

苏 晨（1984—），男，博士研究生，主要研究方向为体育教学、训练和管理。