近红外光谱法测定银黄混合液终点黄芩苷和绿原酸含量*

★ 陈艳刘顺国肖雪刘明颖高建胜龙晓英（.广东药学院 广州50006；.广州白云山明兴制药有限公司 广州5050；3.中山大学南沙研究院 广州5458）

近红外光谱法测定银黄混合液终点黄芩苷和绿原酸含量*

★ 陈艳1**刘顺国2肖雪1,3***刘明颖2高建胜2龙晓英1（1.广东药学院 广州510006；2.广州白云山明兴制药有限公司 广州510250；3.中山大学南沙研究院 广州511458）

目的：建立银黄混合液终点的近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIR）校正模型，探讨NIR快速测定黄芩苷和绿原酸含量的方法。方法：采用多种光谱预处理方法、波长选择方法结合偏最小二乘法对银黄混合液的光谱图与黄芩苷、绿原酸的含量进行关联拟合，并通过交互检验标准偏差（SECV）、校正标准偏差（SEC）和决定系数（R2）及优选校正模型。结果：建立的黄芩苷、绿原酸的NIR校正模型的预测能力较好。结论：NIR技术可以用于银黄混合液终点阶段的黄芩苷、绿原酸含量。

清开灵注射液；银黄混合液；近红外光谱；在线检测

清开灵注射液是由黄芩苷、金银花等药材经过现代生产工艺制备而成，主要功效为清热解毒、镇静安神，在临床上有着广泛的应用[1]。但是清开灵注射液生产工艺复杂，步骤繁多，尤其是液体配制环节众多，对清开灵注射液的产品质量有着重要的影响[2-4]。清开灵注射液生产过程中有一关键的混合配制工艺即金银花提取液和黄芩苷的混合，混合配制的结果直接影响到后续的生产工艺。该过程目前尚没有良好的检测手段进行实时检测，均需要等到混合配制完毕后取样进行常规理化分析，费时费力、结果滞后，不利于生产的快速放行，不适合中药现代化生产的需要。近红外光谱技术（near infrared spectroscopy，NIRS）是近些年来发展较快的一种过程分析技术，其具有分析快速、多指标成分同时测定、样品基本不需要前处理等多种优点[5-8]。本研究拟采用NIRS技术对银黄混合配制过程的终点进行在线监控研究，提高生产效率。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器 Antaris II型傅立叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，配卤钨灯，InGaAs检测器）；清华大学化学计量学分析系统THUNIR V3.0；W aters2695高效液相色谱仪（美国W aters科技有限公司）；CPA-224S型电子天平（德国Sartorius集团）；Synergy UV水纯化系统（美国Merck M illipore公司）。

1.2 试剂与样品 黄芩苷对照品（批号110715-2011 17）、绿原酸对照品（批号110753-200413）均采购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯（Merck公司）；甲酸、磷酸均为分析纯（北京现代东方精细化工有限公司）；超纯水自制；其余试剂均为分析纯。银黄混合配制液样品（广州白云山明兴制药有限公司）。

2 实验方法

2.1 指标成分的测定 参照2010年版《中国药典》规定的方法和清开灵注射液质量标准（2012年版）对银黄混合液中有效成分进行含量测定。

2.2 银黄混合液的制备及取样 在银黄混合罐内预先放入黄芩苷粉末，逐渐流加金银花提取液并同时搅拌，自流加完毕，混合数分钟后，开始混合过程的取样。在银黄混合罐罐体设置一个取样窗口，实时采集混合配制过程中的银黄混合液样品。

2.3 近红外光谱扫描 采用近红外光谱透射探头插入银黄混合罐内，探头置于液面1/3下。采集不同批次的透射光谱图，光谱扫描范围10 000～4 000 cm-1，扫描次数32次，分辨率为8 cm-1，液体样品池为2mm光程的石英比色皿，实验采用空气为参比进行光谱扫描，测量时温度为25℃，湿度为50%。

2.4 数据处理[9-12]将样品分为校正集、检验集及外部预测集。

采用多种预处理方法如无预处理、卷积平滑、卷积求导、多元散色校正、标准正态变量变换和归一化中的一种或几种对光谱进行优化。采用多种波长选择方法如全波长法、相关系数法、迭代优化等对光谱进行波长选择。采用偏最小二乘法对样品的光谱数据与其性质含量值做回归拟合计算，建立校正模型。

2.5 模型评价参数 采用交互验证标准偏差（standard error of crossvalidation，SECV）、校正标准偏差（standard error of calibration，SEC）、主因子数（numbersof latent variable，LV）、决定系数（coefficient of determ ination，R2）等作为模型的评价参数。通过SECV和SEC优选出每种不同波长选择方法下的模型，然后以LV和R2做比较优选最佳模型。

3 结果与应用

3.1 银黄混合液中主要指标成分的含量测定结果按照“2.1”项下的方法测定银黄混合液样品中的主要指标成分黄芩苷、绿原酸的含量，结果如表1所示。

3.2 校正模型的建立与选择

3.2.1 样品光谱图的采集与预处理 按照“2.3”项的方法对“2.2”项中采集的银黄混合液进行光谱采集，如图1A所示。

表1 银黄混合液中黄芩苷、绿原酸含量 mg·mL-1

图1 银黄混合液近红外光谱图

表2 黄芩苷校正模型的优选

表3 绿原酸校正模型的优选

图2 黄芩苷校正模型参数图

3.2.2 校正模型的建立 按照“2.4”项下的预处理方法对“3.2.1”项下采集到样品光谱图进行预处理，如图1B-I所示。

按照“2.4”项下的波长选择方法对“3.2.1”项下经预处理后的光谱图与“3.1”项下测定的黄芩苷、绿原酸含量通过PLS进行拟合回归，建立多个校正模型，结果如表2和表3所示。

3.2.3 校正模型的主要参数 通过表2和表3，对比各个模型的具体参数，如LV、SEC、SECV等，最终选择的校正模型为：（1）黄芩苷，光谱范围为5804.685~ 6402.509 cm-1，光谱预处理方法为归一化，主因子数为4，得到SEC为0.6945，SECV为0.9950，R2为0.9985；（2）绿原酸，光谱范围为5793.114~6387.082 cm-1和7586.588~8180.556 cm-1，光谱预处理方法为卷积平滑，主因子数为4，得到SEC为0.0014，SECV为0.0019，R2为0.9997。

图2和图3分别为黄芩苷和绿原酸校正模型的参数图。从图可以看出，黄芩苷和绿原酸的校正模型均较好，可用于检验集的数据预测。

3.2.4 校正模型的检验 将“3.2.3”项下选择好的校正模型，预测验证集中的8个样品，其结果如表4所示。从表4可以看出，银黄混合液中的黄

图3 绿原酸校正模型参数图

表4 银黄混合液验证集结果分析 mg·mL－1

图4 银黄混合液校正模型的在线检验（A.黄芩苷；B.绿原酸）

芩苷和绿原酸含量预测均较准确，偏差较小，均在可接受的误差范围内。该模型可以用于实际生产过程中银黄混合液的在线检测。

3.3 校正模型的应用 将经过检验的银黄混合液的校正模型，导入清开灵注射液生产在线监控系统，在线检测银黄混合液中的黄芩苷和绿原酸的含量，如图4所示。

4 讨论

银黄混合配制阶段是清开灵注射液生产过程中的关键配制工艺点，其混合效果的结果直接影响了后续工段的顺利开展。本试验采用了近红外光谱技术对银黄配混阶段混合终点的主要成分黄芩苷、绿原酸进行了快速的含量测定，预测结果与标准方法测定结果基本一致。在线近红外光谱技术可以推广应用于中药注射液的生产过程，给其生产带来巨大的便利，有效的控制生产过程中的质量参数。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：70-71.

［2］肖雪，付婵，罗国安，等.清开灵注射液中大分子物质相对分子质量高效凝胶渗透色谱研究 [J].中国药学杂志，2011，46（24）：1 946-1 948.

［3］史留喜，肖玉春，李莎莎，等.清开灵注射液不良反应及对策分析[J].江西中医药，2011，42（11）：30-32.

［4］肖雪，付婵，罗国安，等.中药注射剂中类蛋白质成分测定[J].中国药学杂志，2012，47（21）：1 768-1 769.

［5］Xue Xiao,Jinfang Ma,Fahuan Ge,et al.Application of near infrared spectroscopy for rapid analysis ofwater extracting solution of Lonicerae Japonicae Flos[J].Journal of Innovative Optical Health Sciencs,2014,7（4）:1 350 063.

［6］Jingbo Liang,Dalong Zhang,Xuan Guo,et al.At-line nearinfrared spectroscopy for monitoring concentrations in temperature-triggered glutamate fermentation[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2013,36:1 879-1 887.

［7］肖雪，梁琼麟，王义明，等.近红外光谱技术在医药领域中的应用进展[J].现代仪器，2011，17（5）：9-12.

［8］陆婉珍.现代近红外光谱分析技术（第二版）[M].北京：中国石化出版社，2007.

［9］Xue Xiao,Yuanyuan Hou,Jun Du,et al.Determination of main categories of components in corn steep liquor by near-infrared spectroscopy and partial least-squares regression[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60（32）:7 830-7 835.

［10］潘建超，薛东升.近红外光谱相似度用于中药提取物质量控制方法的研究[J].中国医药工业杂志，2011，42（5）：340-343.

［11］曹吾，李卫军，王平，等.近红外定性分析模型的稳健性与适应性分析[J].光谱学与光谱分析，2014，34（6）：1 506-1 511.

［12］杨皓旻，卢启鹏.血清中胆固醇的近红外光谱测量及模型适用性研究[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：375-378.

Rapid Determ ination of Baicalin and Chlorogenic Acid of Ying-huang M ixture by Near Infrared Spectroscopy

CHEN Yan1,LIU Shun-guo2,XIAO Xue1,3,LIU M ing-ying2,GAO Jian-sheng2,LONG Xiao-ying1
1.Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;
2.Guangzhou Baiyunshan Mingxing Pharmaceutical Co.Ltd.,Guangzhou 510250,China;
3.Nansha Research Institute,Sun Yat-sen University Guangzhou 511458,China.

Objective:To establish amixed calibration model to determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yinhuangmixing process by near infrared spectroscopy（NIR）.Methods:A variety of spectroscopy pretreatmentmethods and several wavelength selection methods combined the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yinhuang mixture were used to build the calibration models by partial least squares regression,and the standard error of cross validation,the standard error of calibration and the coefficient of determination were used to evaluate themodels.Results:The predictive ability of the models was good as referencemethod.Conclusion:NIR can be used to rapidly determine the concentrations of Baicalin and Chlorogenic acid of Yin-Huangmixture during the Yin-Huangmixing process.

Qingkailing Injection;Yin-Huang Mixture;Near Infrared Spectroscopy;Online

R284.1

A

2014-08-04）编辑：曾文雪

“重大新药创制”科技重大专项（2011ZX 09201-201）。

**第一作者：陈艳（1989-），女。研究方向：中药制剂与开发。E-mail：994605413@qq.com。

***通信作者：肖雪，博士。研究方向：中药质量分析与生产过程智能控制。E-mail：erxiaohappy@163.com。