地黄内生菌的分离鉴定及其抑菌活性测定

★ 元辉明 朱金华 马广强（江西中医药大学生命科学学院 南昌330004）

地黄内生菌的分离鉴定及其抑菌活性测定

★ 元辉明 朱金华 马广强*（江西中医药大学生命科学学院 南昌330004）

对河南焦作产鲜地黄的内生菌进行分离、纯化，对其形态学、生化、16S rDNA序列进行分析及抑菌活性进行测定，初步了解该菌的相关特性并为其资源的开发利用提供参考。方法：对鲜地黄用营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基培养，用划线法进行分离与纯化，然后用革兰氏染色、生化管、16S rDNA序列分析鉴定、药敏试纸抑菌实验对内生菌及其抑菌性进行鉴定。结果：筛选得到的鉴定菌在革兰氏染色及镜检后鉴定显示1号、2号和3号菌均为梭状细菌，4号为杆状细菌；生化管实验的颜色变化显示1号、2号和3号菌为梭菌属细菌，4号菌为土壤农杆菌；16S rDNA的鉴定结果表明3号菌为苏云金芽孢杆菌,3号菌对三种病原微生物的抑菌作用不明显。结论：地黄中分离纯化得到的3号菌的抑菌活性不显著。

内生菌；分离纯化；革兰氏染色鉴定；生化管鉴定；PCR

内生菌是指一类在其部分或其全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。关于内生菌的药用活性成分，我国学者对一些传统药用植物的内生菌进行了深入研究，发现了许多药用活性成分,有些内生菌在非药用植物体内也可以产生一些对病原菌有拮抗作用的活性成分。通过对鲜地黄（Rehmannia glutinosa）的内生菌的分离纯化，研究某类内生菌的抑菌性，从而了解该类菌与地黄的互惠共生关系，对该类菌进行分离与纯化，其代谢产物的药性研究对地黄的产量具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料:

1.1.1 实验样品 河南焦作鲜地黄

1.1.2 实验药品 营养琼脂；玫瑰红钠琼脂培养基；营养肉汤；生理盐水；结晶紫溶液；卢戈氏碘液；95%的酒精溶液；复红溶液；肠杆菌科细菌生化鉴定管；3种病原菌（大肠杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌）；琼脂糖；TAE；EB替代染料；细菌基因组提取试剂盒；溶菌酶；m ix；上、下游引物；M arker等。

1.1.3 实验仪器：电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）,高压蒸汽灭菌锅（上海三申有限公司）,隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）,凝胶成像系统（Fluorchem M）等。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制与灭菌 玫瑰红钠琼脂培养基：称取玫瑰红钠琼脂培养基粉末6.2g用蒸馏水配制成200m l培养液；高压蒸汽灭菌后分装到培养皿中。

营养琼脂：称取营养琼脂粉末9.0g用蒸馏水配制成200m l；培养液高压蒸汽灭菌后分装到培养皿中。

营养肉汤：称取营养肉汤粉末3.6g用蒸馏水配制成200m l培养液。

生理盐水：将配置好的0.9%的生理盐水分装成10支（9m L/支）。

1.2.2 地黄内生菌的培养与分离纯化 地黄内生菌的培养：取一块河南焦作原产地地黄，先用蒸馏水水洗干净，然后去超净工作台操作。先点燃酒精灯，然后将刀片在酒精灯火焰上过几下，确保刀片无菌，然后用刀片将地黄表皮切除，将已去表皮的地黄切取四小块，将这四个地黄切块置于盛有75%的酒精的烧杯中，两分钟后取出，用三蒸水冲洗四次后，置于干净烧杯中。取玫瑰红钠琼脂培养基和营养琼脂培养基各一个，用镊子在酒精灯上烤几下，然后各自夹取两块地黄切片均匀放于两个培养基中。最后将两个培养基放于30℃恒温箱中培养48h。

内生菌的分离与纯化：取有特殊形态的菌落，用三线法划线分离细菌后于30℃恒温箱中培养48h以获得单菌落。

1.2.3 地黄内生菌的液体培养 将纯化的1号、2号、3号和4号内生菌接种至装有营养肉汤的试管中进行液体培养，放于37℃液体摇床中进行液体培养，培养48h。

1.2.4 地黄内生菌的平板涂布计数 地黄切片：取一块地黄，先用蒸馏水冲洗干净，在无菌操作条件下，用小刀将表皮切除，然后切成小片，再于电子天平上称取1克地黄切片。将此切片于75%的酒精中浸泡一分钟后，再用三蒸水冲洗四次，冲洗干净后。再在无菌条件下，把此切片放于已灭菌的研钵中，用移液枪向研钵中加入5mL生理盐水，然后进行研磨，再用移液枪吸取2mL于一灭菌的试管中，并用记号笔标记为0，即为原液。另外再用移液枪吸取1mL原液备用，用于原液DNA提取，用于后面的实验，并标记为原液--DNA。

原液梯度稀释：将三管9mL的三蒸水排列好，按10-1、10-2和10-3依次编号。在无菌操作条件下，用1mL无菌移液枪吸取1mL原液于装有9mL三蒸水并标有10-1的试管中，将移液枪吹洗三次，摇匀即为10-1浓度菌液。1mL移液枪更换枪头后，用同样方法，制成10-2和10-3浓度的菌液。

平板涂布与培养：将已经准备好的玫瑰红钠琼脂培养基若干个放于超净工作台上，点燃酒精灯，用1mL移液枪在已剩有1mL原液的试管中吸尽1mL原液，然后在酒精灯旁操作，将此1mL原液打入一个玫瑰红钠琼脂培养基中，再用已灭菌了的涂布棒杆匀菌液，最后用记号笔在此培养基平板上标记1号。用同样方法将10-1、10-2和10-3梯度的菌液吸取1mL后涂布于培养基上并标记为2号、3号和4号。最后将这四个平板放到30℃恒温箱中培养48h。

1.2.5 革兰氏染色法 革兰氏染色鉴定细菌的显微形态。

1.2.6 生化微量鉴定管鉴定 常用的生化鉴定管对细菌进行生化鉴定。

1.2.7 PCR实验

1.2.7.1 试剂盒方法提取细菌总D N A。

1.2.7.2 PCR反应 用取菌DNA 4μL，再加入10μL mix和上、下引物各3μL，制成20μL的PCR反应体系。然后将装有20μL的PCR反应体系的离心管放进PCR仪。在PCR仪设置程序，一个循环：95℃（30 s），55℃（30 s），72℃（1.5 min）。如此循环30次。

1.2.7.3 PCR产物电泳鉴定 配制成1%的琼脂糖溶液；每孔加入2μL PCR产物；80 V电泳25min，用紫外透视仪观察扩增条带，与Maker长度对照，若条带与引物设计时的扩增条带相符，PCR产物则送往生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.8 抑菌实验

1.2.8.1 病原菌平板划线涂布 大肠杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌涂布整个平板后倒置平板。

1.2.8.2 药敏试纸 取浸泡内生菌细菌培养液的药敏纸片均匀粘贴到涂布病原菌的固体培养基上，37度，培养24小时观察结果。

2 结果

图1 地黄内生菌的分离纯化。

图2 革兰氏染色结果

表1 生化微量鉴定管鉴定结果表

2.1 地黄内生菌的培养 共分离到四株怀地黄植物内生菌，见如图1。

2.2 革兰氏染色及显微观察结果 见图2，其中1号、2号、3号菌为革兰氏阳性菌，4号菌为革兰氏阴性菌。1号、2号、3号菌呈梭状，有鞭毛，芽孢椭圆或球形孢囊膨大；4号菌呈杆状，有鞭毛，无荚膜。

2.3 生化微量鉴定管鉴定 见表1。由实验结果可以得出的是四种菌生化反应各异，参照伯杰氏细菌鉴定手册知道1号、2号和3号菌是梭菌属，且3号菌为苏云金芽孢杆菌，4号菌为枯草芽孢杆菌。

图3 PCR扩增产物

2.4 16S rDNA产物电泳结果的分析和测序结果的序列对比分析。

2.4.1 16S rDNA产物电泳结果的分析 见图3。由实验结果可以知道从3号菌的D N A与从地黄切片制成的原液中的D N A扩增的目的基因片段大小相似。（其中marker为5000bp）

2.4.2 测序结果的序列对比分析 经生物公司测序后获得的3号菌的PCR产物扩增片段，在进入N C B I公司的软件序列对比分析获得了进化树信息，见图4。

图4 进化树分析3号菌16S rDNA序列

经进化树图分析后可知3号菌为梭菌属且为苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）。2.5对病原细菌抑菌实验结果 见表2。结果可以知3号菌对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌作用较明显，较可能会分泌一些抗菌物质以抑制金黄色葡萄球菌的生长。

表2 3号菌对病原菌抑菌效果

3 讨论

国内外有很多应用经典方法如细菌的菌落特征、菌体形态、生理生化特性、代谢产物等对细菌进行鉴定的研究，但这些传统的方法鉴定微生物耗时耗力，而且培养条件的改变可能会导致结果发生变化，即鉴定结果很不稳定。随着分子生物学技术的发展，包括荧光定量P C R技术在内的一批新技术的应用，使得微生物学的研究摆脱了传统依靠纯培养分离鉴定的束缚，使快速、全面、准确地反映微生物多样性成为可能。然而虽然现代技术更快、更好、更精确，但也不保证在鉴定过程中失误。因此在本次实验研究中，我采用了传统方法与现代技术相结合的鉴定方法，以使实验结果更准确与可靠。

目前，对许多内生菌产的活性物质研究不完全清楚，难以得到较为纯净的有效成份。这也影响了内生茵的实际应用。但从长远角度看，内生菌的研究会给内生菌的应用带来新的契机，必将给人类的生活带来更大的利益，具有重要和广阔的开发应用前景。

［1］Li Wan-Kui，HU Zhi-Bi．Endophytes and Natural Medicines[M]．Institute of Materia Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，2012.

［2］WU L，HAN T，LIW，et a1．Geographic and tissue influences on endophytic fungal communities of Taxus chinensis var．mairei in China[J]．CurrentMi-crobiology，2013，66（1）：40-48．

Isolation,Identification and Antibacterial Activities of Endophytes in Fresh Rehmannia

YUAN Hui-m ing,ZHU Jin-hua,MA Guang-qiang
JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China.

Objective:Endophytes of henan jiaozuo fresh Rehmannia get endophytes separation,purification,and then on themorphology,biochemistry,16S rDNA identification and the determination of antibacterial activity,preliminary understanding the characteristics of the bacteria and provide data for the development and utilization of its resources.Methods:the fresh Rehmannia nourished with nutrient AGAR culturemedium and rosy sodium,by exploringmethod for separation and purification,and then using gram staining, biochemical tube,PCR and drug susceptibility test paper bacteriostatic experiment of endophytes and their antibacterial sex identification.Results:the identification of bacteria in screening for gram staining and microscopy after identification showed no.1,2 and 3 were fusiform bacteria,4 for rod-shaped bacteria;Biochemical tube experiments showed the color change of the no.1,2 and 3 bacteria for Clostridium bacteria,4 bacteria for soil Agrobacterium;16S rDNA identification results showed that the 3 bacteria for bacteria and fusobacterium thuringiensis bacillus;And 3 isolates on the bacteriostatic action of three kinds of pathogenicmicroorganismswere not obvious.Conclusion:No.3 bacteria's antibacterial activity are not significant.

endophytic bacteria;Separation and purification;Gram staining appraisal;Biochemical identification;PCR

R285.5

A

2014-05-30）编辑：曾文雪

*通信作者：马广强（1977-），男，副教授。研究方向：微生物与免疫学。T el:18770050616,E-m a il:m a g u a n g q i a n g@163.co m。