Nesfatin-1在伴或不伴幽门螺杆菌感染的相关胃病中的表达

王惠 袁琳 崔秀芳 苏菡 赵君宁 王颖 李学良

Nesfatin-1在伴或不伴幽门螺杆菌感染的相关胃病中的表达

王惠 袁琳 崔秀芳 苏菡 赵君宁 王颖 李学良

目的 观察Nesfatin-1在不同胃病(慢性胃炎、消化性溃疡)中的表达,尤其是在合并幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染与非感染者的胃病患者血清及胃黏膜组织中的差异。 方法 收集在南京医科大学第一附属医院内镜中心空腹>10 h并同时行胃镜及13C呼气试验患者共50例,采用ELISA法检测患者血清Nesfatin-1水平,同时取胃黏膜组织行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Nesfatin-1 mRNA,免疫组化检测Nesfatin-l/NUCB2的分布情况。 结果 Hp(-)组患者的血清及胃黏膜组织中Nesfatin-1表达明显高于Hp (+)组患者;Hp (+)组中消化性溃疡患者血清及胃黏膜组织中Nesfatin-1表达明显低于非溃疡组。 结论 Nesfatin-1表达与Hp感染相关,两者可能共同参与胃酸分泌调节。Nesfatin-1高表达可能对胃内Hp有抑制作用,从而可能影响胃十二指肠疾病的发生。

Nesfatin-1; 幽门螺杆菌; 胃酸

Nesfatin-1在2006年10月首次发现,是一种由82个氨基酸构成的神经多肽,它的前身是在下丘脑表达的核组蛋白2(nucleobindin 2,NUCB2)[1]。作为一种新发现的厌食肽,它在中枢和外周广泛表达。在外周组织中,Nesfatin-1阳性表达于十二指肠、胰岛、睾丸以及胃黏膜内分泌细胞等[2-3],其中以胃肠道细胞中Nesfatin-1表达程度最强。进一步研究显示,Nesfatin-1的作用机制与Ghrelin相反[4],可抑制胃酸分泌[5-7]。

幽门螺杆菌(Hp)是定植于胃黏膜表面与黏膜层之间的微需氧菌。Hp感染能诱发胃黏膜发生慢性炎性反应,进而可导致慢性胃炎、消化性溃疡(Ulcer)和胃部恶性肿瘤等疾病。有研究显示,胃液pH值低的胃肠疾病患者,Hp阳性率较高;而胃液pH值高的患者,Hp阳性率较低[8]。另外Hp感染所致的高促胃泌素血症可能是引起高胃酸分泌的原因之一[5]。Nesfatin-1可抑制胃酸分泌,可能影响Hp在胃内的生存,对Hp相关性胃病产生一定的影响,但有关Nesfatin-1与Hp的关系,国内尚无文献报道,因此本文初步观察了慢性胃炎及Ulcer患者胃黏膜及外周血清中Nesfatin-1表达情况,特别是观察了Hp(+)组和Hp(-)组的患者Nesfatin-1的表达,以期了解Nesfatin-1与Hp对相关胃病的影响,进一步探讨二者在胃酸分泌环节如何关联。

1 对象与方法

1.1 病例采集 选择2014年5～6月在南京医科大学第一附属医院消化科门诊就诊的患者共50例,其中女22例,男28例,年龄范围18～72岁,平均(47±13)岁。检查当天空腹≥10 h,所有患者均行胃镜检查并取活检,胃镜检查后行13C尿素呼气试验,并收集患者一般资料,分为Ulcer组、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)组、慢性浅表性胃炎(chronic superficial gastritis,CSG)组。留取患者血清及胃黏膜活检组织。

病例排除标准:(1)年龄<18岁或者>80岁;(2)孕妇;(3)超重或肥胖(体质量指数>30);(4)糖尿病;(5)恶性肿瘤;(6)近3月内行抗Hp治疗者。

1.2 患者标本留取及相关数据采集 所有患者均签署知情同意书,采集静脉血2 ml置于黄头采血管,并立即4 ℃ 3000 r/min离心15 min,取上清液,于-80 ℃保存。胃镜下活检胃窦黏膜组织1～2块,液氮速冻后-80 ℃保存,同时活检胃窦黏膜组织2～3块甲醛浸泡。记录患者胃镜病理结果及13C尿素呼气试验DOB值(DOB值>4提示Hp阳性,DOB值<4提示Hp阴性)。

1.3 酶联免疫法(ELISA)检测血清Nesfatin-1 将-80 ℃保存的患者血清置于4 ℃预冷的含EDTA-Na和抑肽酶的试管中,2000 r/min低温离心15 min。参照ELISA试剂盒说明书(RD,美国),检测血清Nesfatin-1水平。

1.4 免疫组化染色检测患者胃黏膜Nesfatin-1 Nucleobindin 2抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗均购自南京力天生化试剂销售中心。所有纳入研究的患者胃镜检查时于窦大窦小处取胃黏膜2～3块。常规固定、包埋、切片、脱蜡、脱水,柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)100 ℃热修复20 min,3%正常羊血清封闭30 min,Nesfatin-1单克隆抗体(1∶10 000)4 ℃孵育过夜及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗室温下孵育30 min,DAB显色30 s,苏木精复染1 min,中性树胶封片,显微镜观察。阴性对照实验用正常羊血清代替一抗。

1.5 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测患者胃黏膜Nesfatin-1 mRNA表达 按Trizol试剂说明书提取胃黏膜组织总RNA,并依照反转录试剂盒说明反转录为cDNA,按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明进行RT-PCR,循环条件为:95 ℃15 min;95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。该实验中以actin mRNA作为内参。引物序列为:HDC上游:5′-GCATGGACCACCAAGCTCTTCTAA-3′;下游:5′-CTTCCAGATCACTTGTTGCCGCTTT-3′;actin上游:5′-AAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′;下游:5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

1.6 统计学分析 用SPSS 17.0统计学软件进行实验数据分析,正态计量数据用均数±标准差表示,组间比较采用t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析;率的比较采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp在不同胃病患者中分布 不同胃病患者的Hp感染情况见表1。结合胃镜报告及病理组织学检查,CAG组、Ulcer组和CSG组患者Hp感染率差异有统计学意义,其中Ulcer组患者的Hp感染率明显高于CAG组和CSG组。

表1 不同胃病患者的Hp感染情况(n)

注:与Ulcer组比较,*P<0.05

2.2 Nesfatin-1在Hp(-)组与Hp(+)组患者中的表达 Hp(-)组和Hp (+)组患者血清Nesfatin-1含量分别为(13.130±1.055)pg/ml、(2.552±0.664) pg/ml;胃黏膜组织中Nesfatin-1 mRNA相对表达量分别为0.046±0.014、0.014±0.004, Hp(-)组患者血清及胃黏膜组织中Nesfatin-1表达水平均明显高于Hp (+)组,差异均有统计学意义(P<0.01,P=0.043)。见图1，2。

2.3 Nesfatin-1在Ulcer组与非Ulcer组患者中的表达 Ulcer组和非Ulcer组患者血清Nesfatin-1含量分别为(1.248±0.372) pg/ml和(3.550±0.552) pg/ml,差异有统计学意义(P=0.005);胃黏膜组织Nesfatin-1 mRNA相对表达量分别为0.010±0.003和 0.034±0.009,差异有统计学意义(P=0.019)。见图3,4。

2.4 Nesfatin-1在Hp(-)组患者中的表达 CSG组及CAG组中Hp(-)患者黏膜组织Nesfatin-1 mRNA相对表达量分别为0.067±0.016和0.011±0.006,差异无统计学意义(P=0.154),见图5。

2.5 Nesfatin-1在Hp阴性组与阳性组患者中的表达分布 Nesfatin-1/NUCB2免疫阳性物质为棕褐色颗粒,存在于细胞质,而细胞核和细胞膜均无表达,用正常羊血清代替一抗的阴性对照组无表达。通过免疫组化学方法检测患者胃黏膜组织Nesfatin-1表达,结果显示Hp(-)组胃黏膜组织Nesfatin-1阳性表达率为53.3%,高于Hp (+)组的22.2%,差异有统计学意义(P=0.041)。Hp(-)组患者胃黏膜Nesfatin-1表达明显(图6),而Hp (+)组患者胃黏膜免疫组化切片通过放大200倍、400倍分布不明显。

图1 不同Hp感染情况患者血清中Nesfatin-1表达

图2 不同Hp感染情况患者胃黏膜组织Nesfatin-1 mRNA表达

图3 Ulcer组和非Ulcer组患者血清Nesfatin-1表达

图4 Ulcer组和非Ulcer组患者胃黏膜组织Nesfatin-1 mRNA表达

图5 CSG组和CAG组Hp(-)患者黏膜组织Nesfatin-1 mRNA表达

注:箭头所指为Nesfatin-1/NUCB2免疫阳性细胞的所在部位图6 Nesfatin-1/NUCB2在人胃黏膜中阳性表达

3 讨论

众所周知,胃酸分泌调节是一个复杂的过程。外周多种激素和中枢神经相互协调调节胃酸分泌,而胃酸在胃生理功能方面起着重要作用,不同胃肠疾病胃酸分泌情况不同。有研究表明Nesfatin-1很可能通过激活迷走神经抑制胃酸的分泌,但这个抑制过程是通过直接作用于壁细胞,还是通过间接作用于胃黏膜其他细胞,抑或通过作用于某种受体,目前尚未清楚,还需深入研究[9-10]。Hp的感染率与胃酸的分泌密切相关,进而影响某些疾病的发生。

Nesfatin-1是日本学者发现的一种新的厌食肽,包含82个氨基酸,起源于NMCB2。NMCB2在激素原转化酶的作用下水解为N-端片段Nesfatin-1和2个C-端肽Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有Nesfatin-1能够抑制大鼠的摄食量和体质量的增加。Nesfatin-1表达于下丘脑弓状核、室旁核、脑干的迷走神经背核、孤束核以及胃、胰腺、十二指肠等外周组织中。Nesfatin-1可以调节多种生理活动,包括抑制摄食、能量调节、胃肠运动和胃黏膜的保护作用等[11]。研究还发现:Nesfatin-l主要与胃泌酸腺的中间部分的X/A样细胞分泌的Ghrelin共存,Nesfatin-1还在泌酸腺基底部的少数细胞中与生长抑素和组氨酸脱羧酶共存[12],提示Nesfatin-l在胃黏膜的分泌功能中起着重要作用。动物实验表明,侧脑室注射Nesfatin-1后,不仅抑制大鼠的胃酸分泌,而且减少胃黏膜中组胺合成的关键酶组氨酸脱羧酶(HDC)mRNA及蛋白的表达量,从而导致胃体黏膜中组胺的含量降低,达到抑制胃酸和胃蛋白酶的作用[13]。而研究表明随着胃液pH的升高,Hp阳性率呈下降趋势,这可能与胃内酸性环境改变抑制Hp生长有关。一方面,由于胃酸分泌的减少,可允许竞争性细菌的过度生长,进而导致Hp从其生态小镜中去除[14];另一方面也可能与胃酸分泌下降而延长Hp IgA的免疫活性有关[15]。反过来Hp感染也影响着胃酸的分泌。综合以上,我们认为Nesfatin-1及Hp均参与胃酸分泌的调节环节。

通过本研究发现,不同的胃病患者其Hp感染存在着明显的差异，Hp(+)患者血清及胃黏膜组织的Nesfatin-1水平明显低于其Hp(-)组,Ulcer患者的血清及胃黏膜组织Nesfatin-1水平明显低于非溃疡患者。上述现象可能是由于Nesfatin-1与Hp在胃酸分泌的某些环节存在一定的拮抗作用,具体机制目前尚不明确。低Nesfatin-1水平患者胃内pH值偏低,从而有利于Hp的感染,进而引起相关消化系统疾病的发生。由于本研究纳入样本量较少,以上结论有待进一步更大样本的研究来证实,以进一步为临床工作提供指导。

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Expression of Nesfatin-1 in patients with gastropathy complicated with or without Helicobacter pylori infection

WANGHui,CUIXiu-fang,SUHan,ZHAOJun-ning,WANGYing.DepartmentofGastroenterology,JiangsuProvinceGeriatricHospital,Nanjing210024,China;WANGHui,YUANLin,LIXue-liang.DepartemtofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicaluniversity,Nanjing210029,China

Objective To investigate the plasma or gastricmucosa levels of Nesfatin-1 in the patients with benign gastropathy, and to elucidate the association between Helicobacter pylori(Hp) colonization and expression of Nesfatin-1 in human. Methods Fifty adult patients in Endoscopy Center of the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, who underwent both the upper gastrointestinal endoscopy and13C breath test were randomly enrolled. Blood samples were collected after a 10 hours fast before endoscopy and biopsies were endoscopically taken from the antrum. The plasma levels of Nesfatin-1 and gastric mucosa expression levels of Nesfatin-1 mRNA were detected by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. The distribution of Nesfatin-1 was examined with immunohistochemical (IHC) staining. Results The plasma and gastric mucosa levels of Nesfatin-1 were both significantly higher in Hp-negative patients than those in Hp-positive patients. Meanwhile, among those patients with Hp infection, the level of Nesfatin-1 was significantly lower in patients with duodenal ulcer and gastric ulcer than those without ulcers. Conclusions There may be an association between Hp infection and expression of Nesfatin-1 in human. They may jointly play an important role in the regulation of gastric acid secretion. It is suggested that high-level expression of Nesfatin-1 may partly inhibit the colonization of Hp in stomach and then involve in the pathogenesis of gastroduodenal disease.

Nesfatin-1; Helicobacter pylori; gastric acid

210029江苏省南京市,南京医科大学临床医学院(王惠);210024江苏省南京市,江苏省老年医院消化科(王惠,崔秀芳,苏菡，赵君宁，王颖)；210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院消化科(袁琳，李学良)

李学良,Email:ligakur@aliyun.com

R 573.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.018

2015-04-22)