脑白质疏松与空间学习及记忆功能障碍关系的研究

高强 马春丽 张一娜 郑秀海

脑白质疏松与空间学习及记忆功能障碍关系的研究

高强 马春丽 张一娜 郑秀海

目的 探讨脑白质疏松与空间学习及记忆功能障碍的关系。 方法 将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组(n=30)和模型组(n=30),通过结扎双侧颈总动脉构建脑白质疏松模型,术前及术后3月分别进行Morris水迷宫实验,同时观察脑白质的组织学变化。 结果 定向航行阶段,与假手术组相比,模型组寻找隐敝平台能力下降(P<0.05),且于术后第2月开始出现(P<0.05),第3月改变明显(P<0.01);空间探索阶段,2组穿越次数差异无统计学意义(P>0.05);站台周边1路程显示,模型组记忆能力较假手术组降低,此种改变于术后第3月出现(P<0.05)。模型组脑白质病理改变显示质地疏松,出现大量空泡。 结论 脑白质疏松出现一定时间之后可导致空间学习及记忆障碍,并且空间学习能力受损早于记忆能力下降。

脑白质疏松; 学习及记忆; Morris水迷宫实验

脑白质疏松(leukoaraiosis,LA)是一种年龄相关的神经退行性病变,影像学主要表现为脑室周围、半卵圆中心斑点或斑片状的改变,在核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)T2加权像上表现为白质的高信号。目前,关于LA与认知障碍的关系尚缺乏明确结论。国外研究发现脑容积降低与认知功能障碍有关系[1];也有研究认为颞叶萎缩与认知功能障碍有关[2];Van等[3]认为认知功能下降与白质病变关系密切。本研究应用Morris水迷宫实验结合脑室周围白质的组织学改变来探讨LA对大鼠空间学习及记忆能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用2～3月龄健康SD雄性大鼠60只,体质量200～250 g,由黑龙江省哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供[许可证号:SCXK(黑)2013-001]。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:采用随机数字法将大鼠分为假手术组(n=30)和模型组(n=30)。组间鼠龄、体质量比较差异无统计学意义。2组观察至术后3月。造模前及造模后每月均进行水迷宫实验,共4次。每次实验前均从各组随机抽取5只大鼠断头取脑进行组织学观察。将最终剩余10只大鼠的实验数据进行统计学分析。

1.2.2 动物模型的制备:本研究采用永久性结扎双侧颈总动脉 (2-VO)法,制作LA动物模型。大鼠术前禁食12 h、禁水6 h。10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉,仰卧固定,颈前部去毛,碘酒消毒后,沿腹侧颈正中切开,依次剪开筋膜,分离肌肉后从气管旁游离出双侧颈总动脉,以0-4号线分别结扎颈总动脉近心端和远心端后,将其剪断以确保无血流通过。假手术组动物操作同前,分离但不结扎颈总动脉。

1.2.3 实验装置:水迷宫分析系统BW-MWM101由上海软隆科技发展有限公司提供。水迷宫实验按照Patil等[4]和Sase等[5]所述进行操作。实验的设备包括圆形水池,登陆平台,图像采集系统(包括电脑、摄像机、广角变焦透镜、图像采集芯片和显示器)和数据收集、分析软件。水池直径180 cm,高60 cm,内壁为黑色,将水池分为4个象限,池壁上依次标上N、E、S、W字母,任选一象限放置平台(平台与圆心和池壁等距,本实验为第4象限)。平台呈圆柱形,高40 cm,直径为10 cm。测试前用黑色食用色素将水染黑,水变得不透明,这样一方面有利于捕捉信号,另一方面食用色素无毒,水不易变质,且不造成大鼠染色。将水放到高出平台1 cm即可,使平台位于水下,排除了大鼠看到平台的可能。水温保持在22 ℃～24 ℃之间,以免引起大鼠不适,干扰实验结果。

1.3 观察指标 学习记忆能力的测定:大鼠空间学习记忆能力测试Morris水迷宫实验分为2部分:(1)定位航行实验:用于测量大鼠对水迷宫学习的获取能力。实验历时6 d。实验前让大鼠在水中自由游泳2 min,以适应水中的活动。从第2天起,每天上午固定时间进行训练,保持周围环境安静,实验人员不要随意走动,尽可能将室内灯光关闭,利用自然光线。每天训练4次,每次间隔15～20 min。训练时随机选择一个入水点(避免大鼠同一入水点入水),将大鼠面向池壁放入水中,记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间(即潜伏期)及游泳路线。每次训练时间为60 s,如果大鼠在60 s内未找到平台,须将其引至平台,这时潜伏期记为60 s。(2)空间探索实验:用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的保持能力。在第6天撤除水下平台,随机选取入水点(平台所在象限的对侧)将大鼠面向池壁放入水中,测其在60 s内跨过原平台相应位置的次数及站台周边1的路程。

1.4 灌注取脑 灌注方法如下:以胸骨最下端剑突处为出发点,向左右两侧剪开皮肤、肌肉等组织,进入腹腔。将腹部脏器拨向一边,即可看见腹主动脉,止血钳夹闭后,剪破膈肌进入胸腔。充分暴露心脏,在心尖偏左的位置进入穿刺针,固定后,剪开右心耳,生理盐水灌注,约200 ml后改为4%多聚甲醛继续灌注,待大鼠上肢及颈部变硬停止灌注。断头取脑,甲醛继续固定24 h。以视交叉层面为起始,止于视神经发出层面,用于观察脑室周围白质。然后冲洗,梯度酒精脱水,二甲苯透明,再浸蜡包埋,片厚4 μm。用于常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色。

1.5 统计学分析 应用SAS 9.1.3版统计软件,作图用的软件是Graphpad Prism 5.0,所有数值型连续变量的分析采用重复测量方差分析(ANOVA for repeated measurement),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠造模后的改变 大鼠在动脉结扎后可见双侧眼裂明显变小。与假手术组相比,行动迟缓,进食减少,但在1周内均恢复正常。

2.2 2组第4象限路程百分比比较 假手术组在第4象限的路程逐渐增加,模型组除最后1月略有减少外其余呈增加趋势。同组内术后不同时间点与术前比较:假手术组术后各月均较术前显著增加(P<0.01)。模型组术后第1月与术前比较无变化(P=0.275),术后第2月及第3月较术前均明显增加(P<0.001)。同一时间点组间比较,术前及术后第1月2组间差异无统计学意义(P=0.192,P=0.097),术后第2月模型组较假手术组第4象限路程开始减少(P<0.05),术后第3月减少显著(P<0.01)。见表1。

表1 2组第4象限路程百分比的比较

注:与同时间假手术组比较,*P<0.05;与同组术前比较,△P<0.05

2.3 2组潜伏期比较 除术后第3月外,2组潜伏期均随时间延长而逐渐缩短。同组内术后各月与术前比较:2组潜伏期均较术前明显缩短(P<0.01)。同一时间点组间比较:术前及术后第1月2组差异无统计学意义(P=0.146,P=0.062);模型组术后第2月及第3月较假手术组潜伏期延长(P<0.05)。见表2。

表2 2组潜伏期的比较

注:与同时间假手术组比较,*P<0.05;与同组术前比较,△P<0.05

2.4 2组穿越次数比较 撤去平台后,模型组除术后第1月穿越次数较术前增加,其余月份与术前比较改变不明显。假手术组术后均比术前穿越次数增加。但2组间无论是同组不同时间点还是同时间点不同组间的比较均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组穿越次数的比较次，n=10)

2.5 2组站台周边1路程(与站台距离小于水池半径1/4的区域)比较 模型组整体呈下降趋势。假手术组除术后第3月外呈现逐渐增加的趋势。同组不同时间点比较:与术前相比,假手术组术后站台周边1路程明显增加(P<0.01);模型组则无变化(P>0.05)。同一时间2组间的比较显示:术前及术后第1、2月均无统计学差异(P>0.05);术后第3月模型组站台周边1路程比假手术组减少(P<0.05)。见表4。

表4 2组站台周边1路程的比较

注:与同时间假手术组比较,*P<0.05;与同组术前比较,△P<0.05

2.6 LA的病理改变 大鼠脑组织HE染色可见，假手术组各时间点组织学改变无明显差异,脑室周围白质组织结构紧密,血管间隙正常,未见明显疏松。模型组术前与假手术组差异不大,双侧颈总动脉结扎术后第1月:脑室周围白质小范围组织密度降低,出现少量空泡,同时可见增大的血管间隙;第2月:白质病变范围增大密度降低较前明显,空泡增多；第3月:白质出现大量的空泡,组织质地稀疏。见图1。

注:A:假手术组；B：术后第1月；C：术后第2月；D：术后第3月图1 脑室周围白质

3 讨论

认知是人脑接受外界信息,经过加工处理,转换成内在的心理活动,从而获取知识或应用知识的过程,包括记忆、语言、视空间、执行、计算和理解判断等多方面内容。本研究主要检测大鼠的学习及记忆功能,而水迷宫实验定向航行和空间探索正是反映了大鼠的这2种功能,即逃逸潜伏期可以检测获取空间信息的能力,而探索过程主要反映记忆储存及提取再现能力。

脑白质病变是中枢神经系统一种常见的影像学改变,尤其在老年人群中发生率约为60%～90%,尽管对于脑白质病变的研究越来越受到国内外学者的重视,但是其与学习、记忆的关系尚无明确结论[6-7]。本研究发现,LA确与空间学习及记忆障碍有关,但这种障碍并不是突然出现,而是一个逐渐加重的过程。在水迷宫实验中,通过定位航行训练,随着时间推移大鼠寻找隐蔽平台的能力逐渐增强,目标象限路程百分比逐渐增加,潜伏期逐渐缩短。这说明通过训练,2组大鼠空间定位能力均得到提高。但术后相同时间点2组的比较显示,模型组在术后第1月同假手术组相比结果无差异,且同术前相比也无明显差异,但是在术后第2月假手术组结果开始优于模型组,术后第3月2组差异更显著,这说明空间学习能力受损并不是术后马上出现,而是一个随时间积累逐渐加重的过程。空间探索实验结果中2组穿越次数差异无统计学意义。但对站台周边1路程结果分析,2组有统计学差异,这说明假手术组在撤去平台后记忆能力随着实验次数的增加显著增强,而模型组记忆能力受损,于术后第3月开始出现。由此我们可以得出脑缺血可导致LA,在出现LA的初期,空间学习及记忆功能受损并不明显,随着LA时间的延长,有害因素的累积,认知障碍才逐渐出现,并且以空间学习能力受损较为显著,记忆能力的损害相对较轻为其特点。同时,本实验中同一批大鼠多次进行水迷宫实验,从所得结果可以看出反复的记忆训练可以减轻及减缓学习记忆功能的损害。国外研究也发现LA在认知功能下降之前就已经出现[8],同时导致认知功能损害的白质病变需要达到一定的阈值[9],才能出现临床症状。这一结论也在本研究中得到证实。

脑室周围白质与认知功能关系较为密切,而皮层下白质损害相对不重要,在前瞻性人群队列研究中发现脑室旁白质损害越严重,痴呆发病风险越高,而皮层下白质损害与痴呆发病关系不明显。白质病变导致学习及记忆障碍也是由其功能决定的。脑白质主要由神经纤维轴突与胶质细胞构成,是信息传递的重要通路,其中与记忆、情绪、行为等认知功能活动有关的纤维联系分别通过脑室周围形成多种边缘环路与灰质相连,而白质较灰质更不耐受缺血。因此当缺血发生时,由于脑室旁白质病变范围是责任血管的“远端供血区”,即动脉供血的分水岭区;同时供血动脉缺少侧支循环或缺如,因此引起神经纤维脱髓鞘，使白质与皮质之间的联系纤维中断,进而导致学习、记忆功能障碍。本研究证明当缺血发生1月时白质就已经有了脱髓鞘的改变。而相关研究通过电镜观察同样证实在缺血20 d胼胝体和内囊有髓纤维髓鞘变形、板层结构疏松、崩溃,血管旁水肿[10]。但是缺血初期受损的神经纤维数量相对较少,信息传递受到的影响不明显。随着缺血时间延长,脑室周围白质受累面积增大,脱髓鞘明显,空泡增多,导致大量组织疏松。同时皮层神经元出现大量凋亡，于是学习及记忆功能受累,出现临床症状。

综上所述,LA与空间学习及记忆障碍有关。早期对其进行干预可以减慢病情的发展,减轻患者认知功能的损害。

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Association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction

GAOQiang,MAChun-li,ZHANGYi-na,ZHENGXiu-hai.DepartmentofGeriatics,theSecondAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

Objective To investigate the association of leukoaraiosis with spatial learning and memory dysfunction. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham group and model group with 30 rats in each group. Leukoaraiosis model was constructed by bilateral carotid artery ligation. The rats should undergo Morris water maze test for 4 times. Histological changes of the white matter were observed. Results In directional navigation phase,compared with the sham group, learning ability of model group decreased (P<0.05)which began from the second month (P<0.05), and decreased significantly in the third month (P<0.01). In space exploration phase,crossing times of the two groups were of no difference (P>0.05).The data of platform peripheral 1 indicated that memory platform was significantly enhanced in sham group (P<0.01),but weakened in model group. Memory impairment of model group appeared in the third month. Pathology in the model group showed that white matter density decreased and vacuoles appeared. Conclusions Leukoaraiosis could lead to spatial learning and memory disorders. The impairment of spatial learning appeared earlier than memory decline.

leukoaraiosis; learning and memory; morris water maze test

黑龙江省卫生厅基金资助项目(2014-313)

150086黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.11.008

2014-12-30)