温度敏感性水凝胶携带阿利吉仑对心肌梗死后大鼠左室重构的影响

刘 杨，李晓艳，蒋学俊，陈盼盼，李 君，贺 伟

温度敏感性水凝胶携带阿利吉仑对心肌梗死后大鼠左室重构的影响

刘 杨，李晓艳*，蒋学俊，陈盼盼，李 君，贺 伟

目的 探讨水凝胶携带肾素抑制剂阿利吉仑对心肌梗死后大鼠心室重构的影响。方法 70只Wistar大鼠随机分成5组：假手术组(Sham组，0只)、磷酸缓冲液组(Pbs组，15只)、磷酸缓冲液+阿利吉仑组(Pbs+a组，15只)、水凝胶组(Gel组,15只)和水凝胶+阿利吉仑组(Gel+a组，15只)，后4组大鼠分别在心梗模型制作成功后，于心肌梗死区周边注射等体积的磷酸缓冲液、含有1.5 mg阿利吉仑的磷酸缓冲液、1.5%的温度敏感性水凝胶和含有1.5 mg阿利吉仑的1.5%温度敏感性水凝胶；而假手术组只穿线不结扎，心肌梗死4周后，用病理切片方法统计心梗面积和胶原容积分数；Western blot的方法检测心肌梗死后心肌组织中MMP-2、MMP-9、TIMP、TGF-β的蛋白含量。结果 心肌梗死4周后，56只大鼠存活，其中Sham组8只、Pbs组11只、Pbs+a组12只、Gel组12只、Gel+a组13只；Gel+a组的心梗面积和胶原容积分数明显低于Pbs组(P<0.01)；心肌组织中MMP-2、MMP-9、TGF-β的蛋白含量明显低于Pbs组(P<0.05)；而心肌组织中TIMP的含量明显高于Pbs组(P<0.05)；Gel+a组这些作用被进一步增强。结论 温度敏感性水凝胶携带阿利吉仑比单纯应用水凝胶更能改善心肌梗死后大鼠的心室重构，具有协同的心肌保护作用。其可能机制是通过影响MMP-2、MMP-9、TIMP-1的活性及下调TGF-β的表达来影响胶原代谢，减少胶原的合成来改善心室重构及心肌梗死后的心功能。

阿利吉仑；温度敏感性水凝胶；心肌梗死；心室重构

0 引言

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活，RAAS激活后介导炎症反应、细胞增生、纤维化，调节活性物质的基因表达，激活多样细胞外信号转导通路，均与心肌梗死后心脏组织修复及重构有关[1-2]。RAAS包括全身RAAS和局部RAAS，实验证明抑制RAAS后能显著改善心肌纤维化[3]。阿利吉仑最早于2007年由美国FDA批准上市，其主要是通过直接抑制肾素，从而抑制血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ，来抑制RAS系统。在动物实验中发现，阿利吉仑可显著改善心肌梗死后大鼠的改善心室重构[4-6]。

葡聚糖-聚己内酯-甲基丙烯酸羟乙酯共聚N-异丙基丙烯酰胺[Dextran-poly(e-caprolactone)-hydroxylethyl methacrylate/poly(N-isopropylacrylamide)，Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm]水凝胶是一种人工合成的可降解的温度敏感性生物材料。这种新型的高分子材料具有良好的生物相容性，前期试验证明了这种温度敏感性水凝胶注入体内后不具有生物毒性[7]。这种温度敏感性水凝胶在4 ℃时为液态，37 ℃时为固态，因此，该水凝胶可直接注入靶组织并在温度迅速升高的诱导下瞬时局部成胶[7]。利用水凝胶的局部浓度高、缓释、无毒的特点，可提高阿利吉仑在局部心肌组织内的浓度。加上水凝胶本身对心肌梗死后的心室重构有抑制作用，可增加阿利吉仑对心肌梗死后的心肌组织的保护作用。本研究证实，可降解温度敏感型Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶携带阿利吉仑注射于心肌梗死周边区，能取得更好的心脏保护作用。

1 实验方法和材料

1.1 实验动物 70只4周龄雄性大鼠，平均体重160～180 g，购自武汉大学实验动物中心，分笼饲养。

1.2 实验药物 阿利吉仑购自大连美仑公司，水凝胶由武汉大学高分子实验室提供；基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、MMP-9、基质金属蛋白酶抑制剂TIMP-1(Tissue inhibitor metalloproteinase,TIMPs)抗体购自santa公司；转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)抗体购自abcam公司；GAPDH抗体购自杭州贤至生物有限公司。

1.3 心梗模型的建立 将70只大鼠随机分成5组：假手术组(Sham组)、模型对照组(磷酸缓冲液组即Pbs组)、水凝胶组(Gel组)、Pbs携带阿利吉仑组(Pbs+a组)、温度敏感型水凝胶携带阿利吉仑组(Gel+a组)，各组经腹腔注射2%的戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉后，气管插管，正中开胸，暴露心脏后，在左前降支(LAD)近端穿线并结扎，Ⅱ导联出现ST段和(或)T波抬高或降低、结扎线以下心肌颜色变暗为结扎成功。其中假手术组只将缝线穿过冠状动脉不结扎,其余各组在结扎成功后，分别在梗死周边区的4个点注入以下药物，Pbs组：注射75 μL Pbs溶液；Gel组：注射浓度为1.5%的75 μL水凝胶；Pbs+a组：注射75 μL含有1.5 mg阿利吉仑的Pbs溶液；Gel+a组：注射含有1.5 mg阿利吉仑的浓度为1.5%75 μL水凝胶。术后注射3 d青霉素(50万IU/d)预防感染。

1.4 检测指标

1.4.1 注射过量戊巴比妥钠(200 mg/kg)处死实验鼠，随后取出心脏，并用肝素化生理盐水灌洗心脏并分离左心室，每个心脏的一部分用4%多聚甲醛固定48 h，用石蜡包埋，在梗死部位垂直于长轴横向进行心脏切片，厚度4 μm，每个样本在不同层面取3张切片作为代表。行HE染色、改良Masson三色染色，显微镜下观察梗死部位左心室的形态及水凝胶残余情况。采用Image Pro Plus 6.0多媒体彩色病理图像分析软件测量梗死区面积，并计算梗死百分比。梗死百分比=梗死面积/左室总面积×100%。

应用Image Pro Plus 6.0多媒体彩色病理图像分析软件系统拍照，通过灰度调节区分胶原和非胶原成分，Masson染色组织中蓝色为阳性胶原。并进行分析测定，计算心肌胶原含量百分比，即胶原容积分数(Collagen volume fraction，CVF：心肌胶原面积/所测同视野组织总面积，每张切片随机选取10个不重复的视野，取平均值)。

大鼠处死后取心肌梗死周边区的组织，提取组织蛋白后，采用 SDS-PAGE 电泳分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β蛋白的表达。

2 结果

70只大鼠用于本实验，手术过程中死亡7只，造模成功后存活56只，其中假手术组8只，Pbs组、Gel组、Pbs+a组各存活11、12、12只，Gel+a组13只。手术前后各组间相比，大鼠体重未见明显差异(表1)。

表1 各组大鼠体重变化(g)

2.1 心肌梗死面积分析 用Image Pro Plus 6.0多媒体彩色病理图像分析软件分析心肌梗死后发现，与假手术组比较，Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+a组的心梗面积明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与Pbs组比较，Gel组、Gel+a组的梗死面积明显减小，差异有统计学意义(P<0.01)，提示注射Gel及Gel携带阿利吉仑的治疗，有利于改善心肌重构，而Pbs+a组与Pbs组相比，差异无统计学意义(P=0.72)，由于药物在体内无法达到有效的浓度；与单纯Gel组比较，Gel+a组的心梗面积明显减小，差异有统计学意义(P<0.01)(见表2、图1)。

图1 各实验组心脏大体观

表2 各组心肌梗死大鼠梗死面积百分比(%)

注：与Sham组比较，*P<0.01；与Pbs组比较，#P<0.01；与Gel组比较，△P<0.01

2.2 胶原容积分数分析 Masson染色后的心肌组织胶原部分为蓝色，正常心肌组织显红色，显微镜下观察，假手术组无胶原增生，心肌细胞及胶原排列整齐，其余各组均可见明显胶原增生、断裂，排列紊乱(图2)。用Image Pro Plus 6.0多媒体彩色病理图像分析软件分析胶原容积分数后发现，与假手术组比较，Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+a组的CVF明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；Gel组、Gel+a组较Pbs组CVF明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；提示Gel及Gel携带阿利吉仑的治疗有减少胶原沉积的作用；而Pbs+a组与Pbs比较，差异无统计学意义(P=0.76)，Pbs不具有缓释的作用，所以阿利吉仑在体内无法达到有效的药物浓度，无法起到治疗作用；与单纯Gel组比较，Gel+a组的CVF下降更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)，说明水凝胶携带阿利吉仑能够更好地抑制胶原的沉积。

图2 各实验组高倍镜下胶原病理图

表3 各组心肌梗死大鼠胶原容积分数(%)

注：与Sham组比较，*P<0.05；与Pbs组比较，#P<0.05；与Gel组比较，△P<0.05

2.3 Western blot检测蛋白的表达 与假手术组比较，Pbs组、Gel组、Pbs+a组、Gel+a组的 MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显升高(P<0.05)，TIMP-1蛋白水平降低。与Pbs组比较，Gel组、Gel+a组的MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显降低(P<0.05)，TIMP-1的表达较Pbs组明显升高，而Pbs+a组与Pbs组相比，各蛋白表达无明显差异(P=0.723)，Gel+a组与单纯Gel组比较，MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表达明显降低，而TIMP-1蛋白的表达升高(表4、图3、图4)。

表4 蛋白含量统计表

注：与Sham组比较，*P<0.01；与Pbs组比较，#P<0.01；与Gel组比较，△P<0.05，△△P<0.01

图3 各组蛋白含量

图4 各组蛋白含量条形图

3 讨论

心肌梗死发生以后，伴随一系列复杂的病理生理变化，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及细胞外基质的变化，梗死部位的疤痕修复，心肌间质的纤维化，导致左室腔的大小、厚度和形态发生改变，这些改变总称为左室重构(Ventricular remodeling，VR)[8]。心室重构不但影响心肌梗死后急性期的心功能状态，而且是决定急性心肌梗死后心脏事件发生率和远期预后的主要因素[8]。 胶原是细胞外基质的主要成分，约占细胞外基质的85%。心肌胶原网络结构的主要功能是为心肌细胞提供支持框架，维持心室的几何形态，决定心室顺应性。间质胶原正常情况下处于合成与降解动态平衡，随着年龄的增长，胶原合成多于降解，胶原沉积增加；在某些病理状态下，如MI、高血压、心肌炎、心肌病等，心肌胶原分泌增加，但胶原纤维间连接减少，而继发心力衰竭时胶原纤维在心肌细胞间过多地累积，即发生替代性纤维化，胶原和纤连蛋白等ECM组分增加，心肌僵硬性增加，顺应性降低，收缩和舒张功能障碍[9-11]。

本研究发现，各个实验组与Sham组比较，心肌梗死面积和胶原容积百分比均明显升高，说明各实验组心肌均发生了心室重构。其中Gel组与Pbs组比较，心梗面积和胶原容积百分比均明显减小，提示在梗死周边区注射水凝胶可以抑制心肌梗死后心室重构，这与以前的研究结果一致[7-12]。而与单纯注射水凝胶比较，注射水凝胶与阿利吉仑的混合物能进一步降低心肌梗死面积，提示复合物对心室重构的抑制作用更加明显。

基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)由巨噬细胞分泌，其主要作用是降解细胞外基质，目前已经发现大概有20多种，而其中与心室重构关系密切的是MMP-2和MMP-9。Peterson等[13]研究证实了在心肌梗死大鼠心肌组织中MMP-2和MMP-9的含量和活性增高；MMP-2和MMP-9能降解胶原和基底膜成分，导致心肌胶原网络的重构。运用慢性左心室衰竭的动物模型实验发现：随着左室扩大和功能障碍的发展，心肌MMPs的表达水平呈时间依赖性增加，同时伴有细胞外基质结构和成分的改变[14-16]，在心衰的代偿期，MMP-2和MMP-9活性和含量降低，但随着病情的进展，在心衰的失代偿期，MMP-2和MMP-9活性和含量呈现增高的趋势。

本实验也证实，与Sham组比较，MMP-2和MMP-9的蛋白表达升高，与既往的研究结果一致；而与Pbs组比较，干预组Gel组和Gel+a组的MMP-2和MMP-9的含量明显降低，提示Gel及Gel+a可以抑制心梗大鼠的MMP-2和MMP-9的过表达，与单纯的Gel组比较，Gel+a组的MMP-2和MMP-9的含量降低更加明显，这也提示水凝胶携带阿利吉仑能够通过抑制MMP-2和MMP-9的表达来改善心肌重构。

MMPs的内源抑制物主要是TIMPs。MMPs的过度激活能导致MMPs/TIMP比例失调，而MMPs/TIMP比例失衡是导致心室重构和心肌纤维化的重要原因。在人体内TIMPs主要有4种，其中TIMP-1能抑制包括MMP-2及MMP-9在内的大多数MMPs。既往研究发现，心衰患者的MMP-2、MMP-9明显升高，TIMP-1则降低，胶原代谢活跃，但是给予相关的抗心衰药物治疗后，随着MMP-2、MMP-9的相应下降及TIMP-1的升高，心室重构及心功能也得到改善[17-18]。

本研究中也证实了与Sham组相比，各实验组的TIMP-1降低，而与Pbs组比较，Gel组和Gel+a组的TIMP-1明显升高；而Gel组和Gel+a组比较，后者心肌组织中TIMP-1含量升高更明显，提示水凝胶携带阿利吉仑能通过调节MMPs/TIMP的比例平衡而改善心肌梗死后心室重构的作用。

转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)具有双向的作用，一方面对心脏有保护作用；另一方面，TGF-β可以促进内皮细胞和成纤维细胞的增殖，提高心肌组织内纤维粘连蛋白和胶原的表达，降低Ca2+及Mg2+依赖性ATP酶的活性和表达，导致心肌细胞的低分化和纤维组织的大量增生，因此，与心肌纤维化和心室重构的病理过程密切相关[19-20]。

本实验研究发现，在各个实验组，TGF-β明显升高，这也证明了各实验组存在明显的心室重构。但与Pbs组比较，Gel组和Gel+a组的TGF-β明显下降；Gel组与Gel+a组相比，Gel+a组的TGF-β下降更加明显；水凝胶携带阿利吉仑能通过抑制TGF-β的过表达来抑制心室重构。

目前，随着醛固酮拮抗剂、血管紧张素Ⅱ转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂等药物已广泛应用于临床以改善心室重构，其局限性逐渐凸显出来。大量的研究表明，在血管紧张素Ⅱ转化酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂应用过程中，会出现血浆醛固酮水平在短期内下降，长期治疗后仍然增高，即醛固酮逃逸现象[21]。所以现在很多的研究者关注RAAS系统的限速酶-肾素。近年来最引人注目的肾素抑制剂为阿利吉仑，其主要是通过抑制肾素，从而抑制血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ来抑制RAS系统。在动物实验中，阿利吉仑通过影响基质金属蛋白酶的表达，从而显著改善心肌梗死后大鼠的心室重构[4,22]。温度敏感性水凝胶的机械强度与心肌相似,注射后可增加心室壁厚度和增强室壁机械强度，防止梗死区扩展、心室扩大、室壁瘤形成,并减少矛盾运动,从而延缓心室重构，改善心功能[23-25]。此外，Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝胶在体内能缓慢降解，通过其缓释作用，能延长阿利吉仑的作用时间，从而能取得更好的心肌保护作用。

本实验证实了在心脏局部注射水凝胶及阿利吉仑复合物能够抑制胶原的生成，而其机制主要是通过抑制基质金属蛋白酶和转化生长因子的过表达以及上调金属蛋白抑制剂的表达来改善心肌纤维化，从而达到抑制心室重构的目的。

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Effects of aliskren with thermosensitive hydrogel on rat ventricular remodeling after myocardial infarction

LIU Yang,LI Xiao-yan*,JIANG Xue-jun,CHEN Pan-pan,LI Jun,HE Wei

(Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430000,China)

Objective To investigate the effects of aliskren with thermosensitive hydrogel on rat ventricular remodeling after myocardial infarction.Methods Seventy male Wistar rats were randomly divided into five groups,Sham group(n=10),phosphate buffer solution group(Pbs group,n=15),phosphate buffer solution with aliskren group(Pbs+a group,n=15),thermosensitive hydrogel group(Gel group,n=15),thermosensitive hydrogel with aliskren group(Gel+a group,n=15),the four groups(Pbs gourp,Pbs+a gourp,Gel group,Gel+a group)were respectively injected 75 μL phosphate buffer solution,75 μL phosphate buffer solution with aliskren,75 μL thermosensitive hydrogel and 75 μL thermosensitive hydrogel with aliskren into the infarct area of rats after myocardial infarction.Four weeks later,the infarction area percentage and collagen volume fraction after separation of the heart were calculated.Protein expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TGF-β were determined by Western blotting.Results There were 56 rats survived after myocardial infarction:Sham group，n=8;Pbs group,n=11;Pbs+a group,n=12;gel group,n=12;Gel+a group,n=13.The infarction area percentage and the collagen volume fraction was significantly lower in Gel+a group than Pbs group(P<0.01).Compared with the Pbs group,the protein expression of MMP-2,MMP-9,TGF-β were higher in Gel+a group(P<0.05),and the protein expression of TIMP was lower than Pbs group.Conclusion Aliskren with thermosensitive hydrogel can improve ventricular remodeling and cardiac function by regulating down the expression of MMP-2,MMP-9,TGF-β and regulating up TIMP-1 after myocardial infarction.

Aliskren;Thermosensitive hydrogel;Myocardial infarction;Ventricular remodeling

2014-07-23

武汉大学人民医院，武汉 430000

国家自然科学基金(81170307)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501005

*通信作者