ω-3鱼油脂肪乳对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

孙明立，逄 蕾，鞠学鹏，孙海刚，余涧坤，赵海山，姚维范，魏敏杰

ω-3鱼油脂肪乳对辐射损伤小鼠造血系统保护作用的研究

孙明立，逄 蕾，鞠学鹏，孙海刚，余涧坤，赵海山，姚维范，魏敏杰*

目的 研究ω-3鱼油脂肪乳对电离辐射引起小鼠骨髓损伤的影响，旨在阐明ω-3鱼油脂肪乳对辐射性造血损伤的保护作用。方法 采用直线加速器一次性6.0 Gy全身照射ICR小鼠，建立辐射损伤小鼠模型。取各组小鼠外周血用于白细胞(WBC)和血小板(PLT)计数，取骨髓进行瑞氏-吉姆萨染色观察骨髓象改变，流式细胞术检测骨髓细胞凋亡百分率，免疫细胞化学检测骨髓细胞凋亡抑制因子 BCL-XL的表达。结果 与空白对照组(BC组)相比，生理盐水组(NS组)小鼠外周血WBC和PLT计数均明显减少(P<0.05)，骨髓增生降低，早期及晚期凋亡率显著增加(P<0.05)，凋亡抑制因子BCL-XL表达降低；与生理盐水组相比，ω-3鱼油脂肪乳(ω-3组)可显著提高小鼠外周血WBC和PLT计数(P<0.05)，促进骨髓增生，抑制骨髓细胞凋亡率(P<0.05)，增加凋亡抑制因子BCL-XL的表达。结论 ω-3鱼油脂肪乳可以促进骨髓造血系统恢复，对辐射导致的造血系统损伤具有良好的保护作用。

辐射损伤； 造血系统； 细胞凋亡；ω-3鱼油脂肪乳

0 引言

随着社会的进步，辐射给环境和人类健康带来越来越多的危害，其不仅可引起放射病、 内分泌紊乱、 免疫功能低下等近期不良反应，还可诱发血液病等远期不良反应。ω-3 鱼油脂肪乳(尤文)是目前临床上常用的脂肪乳，主要由α-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等组成。目前，关于ω-3 鱼油脂肪乳的研究主要集中于其调控机体炎症和免疫功能[1-2]，而对于其在骨髓造血系统方面的研究报道少见。本研究拟通过探讨ω-3 鱼油脂肪乳对X射线诱导的小鼠骨髓辐射损伤的保护作用及其机制，为ω-3鱼油脂肪乳用于辐射防护提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 ICR小鼠24只，雌雄各半，体重18～20 g，购于吉林大学基础医学院实验动物中心，室温普通饲料饲养，自由饮水进食。

1.2 主要试剂及仪器 ω-3鱼油脂肪乳(华瑞制药有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(北京宝赛生物技术有限公司)；碘化丙啶(美国Sigma公司)；兔抗鼠BCL-XL多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；瑞氏-吉姆萨染液(上海生工生物工程股份有限公司)；PRIMUS-K型X射线治疗机(德国SIEMENS公司)；KX-21N型全自动血细胞计数仪(日本SYSMEX公司)；FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 实验动物分组及处理 将小鼠按体重随机分组如下：①空白对照组(BC组)；②生理盐水组(NS组)；③ω-3鱼油脂肪乳组(ω-3组)。ω-3组小鼠尾静脉注射ω-3鱼油脂肪乳15 mL/kg，BC组及NS组注射等量的生理盐水，1次/d，连续给药4 d。给药第3天，NS组和ω-3组小鼠给予X线一次性全身照射，照射剂量6.0 Gy，BC组小鼠给予假照射。照射后第1天，处死各组小鼠，取外周血及骨髓用于后续检测。

1.4 白细胞及血小板计数 照射后第1天，采用摘眼球采血法取小鼠外周血，用4%的EDTA抗凝，全自动血细胞计数计数WBC及PLT。

1.5 小鼠骨髓象分析 照射后第1天，取小鼠胸骨，用镊子挤压出骨髓，用15 μL的BSA稀释，载玻片上推片，晾干后，采用瑞氏-吉姆萨染色法染色，光镜下观察骨髓象变化。

1.6 流式细胞术分析细胞凋亡 照射后第1天，取骨髓并分离单细胞悬液， PBS洗2遍，弃上清，用200 μL的Bending Buffer重悬沉淀，每个样品中分别加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室温避光孵育15 min，加入300 μL PBS，上机进行检测，利用CellQuest 3.0软件分析数据。

1.7 免疫组化骨髓细胞中BCL-XL的表达 照射后第1天，将骨髓单细胞悬液用PBS洗2遍，弃上清，加入1 mL Tris-HCL，8 min后离心去上清，PBS重悬后制备细胞涂片。免疫组织化学检测、光学显微镜下观察各组小鼠骨髓细胞BCL-XL表达量的变化。

1.8 统计学分析 所有数据均采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用student-Newman-Keuls法进行组间比较；设定检验水准为α=0.05，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ω-3鱼油脂肪乳对辐射小鼠外周血中WBC和PLT计数的影响 照射后第1天，NS组小鼠外周血WBC和PLT计数均较BC组显著降低(P<0.05)；ω-3组小鼠外周血WBC和PLT计数较NS组显著升高(P<0.05)，但仍低于BC，如图1所示。

图1 各组小鼠WBC和PLT计数结果(n=8)

A.WBC计数，B.PLT计数

2.2 ω-3鱼油脂肪乳对辐射小鼠骨髓象的影响 BC组小鼠骨髓象为正常骨髓象；照射后第1天，NS组小鼠骨髓增生显著抑制，表现为增生减低，粒红比降低，造血细胞减少，成熟红细胞大小一致，无明显淡染区等变化；ω-3组小鼠骨髓增生较NS组显著增加，但仍低于BC组，如图2所示。

图2 各组小鼠骨髓象(瑞氏-吉姆萨染色法，1 000×)

2.3 ω-3鱼油脂肪乳对辐射小鼠骨髓细胞凋亡的影响 照射后第1天，NS组小鼠骨髓细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均较BC组显著增加(P<0.05)；ω-3组小鼠骨髓早期凋亡率和晚期调亡率均较NS组降低(P<0.05),如图3所示。

图3 各组小鼠骨髓细胞凋亡百分比(n=3)

2.4 ω-3鱼油脂肪乳对辐射小鼠骨髓细胞中BCL-XL表达的影响 BC组小鼠骨髓细胞BCL-XL呈阳性表达。照射后第1天，NS组小鼠骨髓细胞BCL-XL表达显著降低，几乎为阴性表达；ω-3组小鼠骨髓细胞BCL-XL表达较NS组增加，但仍低于BC组，如图4所示。

3 讨论

ω-3多不饱和脂肪酸(PUFA)是ω-3鱼油脂肪乳的主要成分，包括二十五碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，具有调节细胞膜磷脂类，如花生四烯酸类物质和细胞因子等水解产生的生物活性。ω-3鱼油脂肪乳能对患者的免疫功能和临床指标产生有益的影响[3-4]。本研究发现，ω-3鱼油脂肪乳在辐射损伤后造血系统的修复中起重要作用。

图4 各组小鼠骨髓细胞BCL-XL表达(免疫组化SP法,1 000×)

电离辐射对骨髓的损伤主要表现为造血功能的障碍，而造血功能障碍主要表现为以WBC和PLT为主的全血细胞减少[5]。因此，本研究首先考察ω-3鱼油脂肪乳对辐射小鼠外周血中WBC和PLT计数的影响，结果显示，与BC组比较，NS组的WBC和PLT计数显著降低；与NS组比较，ω-3组小鼠外周血中WBC和PLT计数显著增加。骨髓象是反映骨髓造血能力的直观指标。本研究进一步观察了照射后骨髓象的变化及ω-3鱼油脂肪乳对其的影响，结果显示，ω-3鱼油脂肪乳可部分逆转辐射所致的骨髓增生减慢，这与对外周血中WBC和PLT计数的影响结果一致，提示ω-3鱼油脂肪乳对造血系统具有保护作用。

研究表明， 电离辐射不仅可导致细胞衰老，还可诱导细胞凋亡[6-7],且细胞凋亡是辐射所致骨髓细胞死亡的主要方式。Bcl-2蛋白家族与凋亡的发生关系密切，可分为2类：凋亡抑制基因，包括Bcl-2和BCL-XL等；凋亡促进基因，包括Bax等。Bcl-2和BCL-XL具有同源性，共同表达于造血细胞，但二者作用有差异。BCL-XL高表达于早期造血干细胞， 是支持早期造血干细胞存活的主要效应蛋白，是原始或定向红系祖细胞成熟所必需的成分[8]，同时也能维持未成熟巨核系祖细胞的存活与分化[9]，而Bcl-2在早期造血干细胞中的表达仅1%～4%。本研究观察了辐射引起骨髓细胞凋亡的情况，检测凋亡抑制因子BCL-XL表达的变化及ω-3鱼油脂肪乳对其的影响，以探讨ω-3鱼油脂肪乳对辐射所致造血系统损伤的保护作用机制。结果显示，辐射可引起骨髓细胞凋亡明显增加、凋亡抑制因子BCL-XL表达降低，而ω-3鱼油脂肪乳可抑制骨髓细胞凋亡、促进BCL-XL表达。表明电离辐射可以诱导细胞凋亡，ω-3鱼油脂肪乳可通过促进凋亡抑制因子BCL-XL表达抑制骨髓细胞的凋亡。

总之，ω-3鱼油脂肪乳可通过促进凋亡抑制因子BCL-XL表达抑制骨髓细胞的凋亡，改善骨髓的造血状况，加快骨髓造血功能的恢复，值得临床应用，但其确切的作用机制有待于进一步探讨。

[1] 胡国强，陈威.含ω-3鱼油脂肪乳的肠外营养液对胃肠道肿瘤病人术后免疫与炎性因子的影响[J].肠外与肠内营养,2015,(1):16-19.

[2] 佟飞,高梦颖,王霞,等.ω-3鱼油脂肪乳对严重腹腔感染患者免疫功能的影响[J].第三军医大学学报,2014,36(10):1108-1110.

[3] 胡国强,陈威.含ω-3鱼油脂肪乳的肠外营养液对胃肠道肿瘤病人术后免疫与炎性因子的影响[J].肠外与肠内营养,2015,22(1):16-19.

[4] 唐卫东,陈琪,邵雪波,等.ω-3鱼油脂肪乳剂对脓毒症患者炎症反应和免疫功能的影响[J].全科医学临床与教育，2015,13(1):19-21.

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Protective effect of Omega-3 fish oil fat emulsion on hematopoietic system of mouse suffering radiation injury

SUN Ming-li,PANG Lei,JU Xue-peng,SUN Hai-gang,YU Jian-kun,ZHAO Hai-shan,YAO Wei-fan,WEI Min-jie*

(Department of Pharmacology,School of Pharmacy,China Medical University,Shenyang 110122,China)

Objective To observe the effect of Omega-3 fish oil fat emulsion on mouse bone marrow injury induced by ionizing radiation and to elucidate the protective effects of Omega-3 fish oil fat emulsion on hematopoietic injury caused by radiation.Methods The animal model of radiation injury was established by applying one dose of 6.0 Gy whole-body ionizing radiation by linear accelerator on ICR mice.The peripheral blood was collected to count white blood cell(WBC)and platelet(PLT).Marrow was collected to observe the changes of bone marrow by Wright-Giemsa staining.The apoptosis of bone marrow cell was detected by flow cytometry.The expression of BCL-XL in bone marrow cells was detected by immunocytochemical method.Results Compared with that in the blank control group(BC group),WBC and PLT count in peripheral blood of the normal saline group(NS group)significantly reduced(P<0.05),bone marrow hyperplasia reduced,early and late apoptosis rate increased significantly(P<0.05),BCL-XL decreased.Compared with that in NS group,omega-3 fish oil fat emulsion(omega-3 group)can significantly improve the peripheral blood WBC and PLT count(P<0.05),promote the proliferation of bone marrow,significantly inhibit the apoptosis rate of bone marrow cells(P<0.05),increase the expression of BCL-XL.Conclusion Omega-3 fish oil fat emulsion can promote the recovery of the injured bone marrow hematopoietic system,exert a good protective effect on the radiation injury of hematopoietic system.

Radiation injury;Hematopoietic system;Cell apoptosis;Omega-3 fish oil fat emulsion

2014-11-25

中国医科大学药学院药理教研室，沈阳 110122

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201506004