天麻素对癫大鼠海马氧化应激水平的影响

0 引言

癫疒间是由神经元异常放电而导致大脑机能失调的一种慢性、反复发作性的疾病，发病率高，难以控制。目前，治疗本病仍以药物为主，但患者长期服用化学药物的依从性差，不良反应较大[1-2]，因此必须寻找有效、低毒的治疗药物。天麻作为传统中药，是治疗癫疒间的主要药物之一，其有效成分天麻素具有抗炎、抗氧化作用。本研究旨在通过观察天麻素对戊四氮(PTZ)致痫大鼠的行为学、脑电图、海马超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量的影响，探讨天麻素抗癫疒间的机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂戊四氮及多聚甲醛均为Sigma公司产品；超氧化物歧化酶测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒、丙二醛测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；天麻素(C13H18O7)由江苏宝泽堂医药科技有限公司提供(批号：20100801，纯度：99.2%)。

1.2 动物

1.2.1 动物的分组与处理 Wistar大鼠由长江大学医学院动物中心提供，清洁级健康雄性Wistar大鼠30只，体重280～340 g。随机分为正常对照组(NC组)、戊四氮(PTZ)组、天麻素(GS)组，每组10只。分笼饲养于正常昼夜环境中，正常进食水。实验室安静、通风、空气清洁，温度21～23 ℃，湿度42%～45%。

1.2.2 动物模型的制备 NC组腹腔内给予生理盐水10 mL/kg，1次/d，周期为10 d，第8、9、10天时腹腔注射给予生理盐水45 mL/kg，1次/d；PTZ组腹腔内给予生理盐水10 mL/kg，1次/d，周期为10 d，第8、9、10天时每天腹腔注射戊四氮稀释液(5 g/L)40 mL/kg[3]；GS组腹腔内给予天麻素200 mg/kg，1次/d，周期为10 d，第8、9、10天时每天腹腔注射戊四氮稀释液(5 g/L)40 mL/kg。三组实验于周期第10天终止，完成注射后观察2 h并记录脑电图。

1.2.3 脑电图记录清醒状态下将大鼠固定，采用头皮针电极、双极导联法(额-顶)连接。电极分别取两眼连线中点(额叶)及两耳连线中点(顶叶)插入固定，鼻根部接地线。

1.2.4 行为学观察参照Racine癫疒间发作行为标准[4]进行观察记录：Ⅰ级：面肌抽动；Ⅱ级：节律性动头；Ⅲ级：前肢抽搐；Ⅳ级：躯干及前肢阵挛；Ⅴ级：四肢抽搐、全身阵挛。

1.2.5 标本采集与处理观察2 h后，三组大鼠均行心脏灌注固定、断头取脑，依据文献[5]确定脑及海马部位、形态，制备海马组织匀浆，全过程不超过15 min。

1.2.6 指标测定按照南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶测试盒、丙二醛测定试剂盒说明书操作。采用考马斯亮蓝蛋白检测法检测海马组织中的蛋白含量。

2 结果

2.1 行为变化 PTZ组大鼠给药后平均56 s出现眨眼、动须、节奏性咀嚼、节律性点头、肢体抽搐等表现，其中7只出现Ⅴ级发作，2只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作。GS组大鼠给药后平均12 min出现上述表现，其中1只出现Ⅳ级发作，1只出现Ⅲ级发作，6只出现Ⅱ级发作，2只出现Ⅰ级发作。N组给药前后均无明显变化。PTZ组与NC组、GS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组大鼠行为学改变比较(只)

2.2 脑电图变化 NC组大鼠脑电图表现为α或β波， PTZ组10只大鼠均出现阵发性痫性放电，表现为高电位的棘波、尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波；GS组部分大鼠有尖波、棘-慢复合波、尖-慢复合波出现，PTZ组与NC组、GS组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组大鼠脑电图改变比较

2.3 检测结果三组大鼠海马SOD、GSH-Px活性及MAD含量比较见表3。与NC组比较，GS组、PTZ组的SOD活力明显下降(P<0.05，P<0.01)；与PTZ组比较，GS组SOD活力明显升高(P<0.05)。PTZ组GSH-Px活力较NC组明显降低(P<0.01)，GS组GSH-Px活力较PTZ组明显升高(P<0.05)，GS组GSH-Px活力与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。PTZ组MDA含量较NC组明显升高(P<0.01)，GS组MDA含量较PTZ组明显降低(P<0.01)。GS组MDA含量与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 三组大鼠海马SOD、GSH-Px、MDA指标比较

3 讨论

氧化应激(Oxidative stress)是指机体或细胞内氧自由基的产生与清除失衡，导致活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。近年大量试验发现自由基与癫疒间的发生、发展关系密切，动物试验及临床观察均表明癫疒间时伴有非常活跃的自由基活动[5-6]。有研究表明，活性氧自由基可以增加通过膜的脂质过氧化以及减少致痫灶的GSH-Px水平，引起神经元变性[7]。另外，MDA是自由基脂质过氧化的主要代谢产物，其含量可以反映机体脂质过氧化的程度，间接反映氧化应激水平。Gulati等[8]研究也证实癫疒间组动物脑组织匀浆中的MDA水平升高，而抗氧化剂预处理可以减轻这一改变。SOD是机体非常重要的自由基清除剂，两者活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力。Eun等[9]报道，SOD与癫疒间的发病机制存在明显联系。Ilhan等[10]利用戊四氮制作大鼠癫疒间模型，来研究厄多半胱对其氧化应激的改善作用，证实癫疒间过程存在氧化应激。笔者前期研究发现，自由基清除剂依达拉奉可以有效减轻癫疒间大鼠的发作次数，并且对癫疒间大鼠皮质、海马的谷氨酸及其受体、转运体都有抑制作用，因此也证明自由基在癫疒间的发生与发展中起重要作用[11]。

天麻为兰科天麻属植物天麻(Gastrodin elala BL)的干燥块茎，主产于云南、四川、陕西及贵州等地，主要有抗炎、清除自由基、抗凋亡效应[12-13]。天麻的主要药物活性成分为天麻素(对羟基苯甲醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。有研究表明，天麻的抗癫疒间活性主要是通过天麻素来完成的[14]。此外，笔者在长期临床工作中发现，对于常规西药难以控制的癫疒间(特别是癫疒间持续状态)，合用天麻素注射液，可以更好地控制癫疒间发作(与对照组比较，患者发作持续时间更短，发作次数明显减少，癫疒间样放电明显抑制)。对于天麻素的具体抗癫疒间机制，国内外学者也进行了初步探讨。Xu等[15]研究发现，天麻素可以明显抑制低氧诱导的细胞外谷氨酸水平的升高；赵燕玲等[16]报道，海人酸诱导大鼠大脑皮层神经元凋亡过程中EphA4表达增高，天麻素在这一过程中抑制EphA4表达，对神经元具有一定保护作用；穆朝娟等[14]发现，天麻素能减轻戊四氮致痫大鼠海马区神经元、星形胶质细胞和血管内皮细胞的损伤，从多个层面保护脑组织，减轻由癫疒间导致的损伤；曹亚芹等[17]研究表明，天麻素能够降低致病大鼠惊厥的易感性，抑制大鼠颞叶和海马区Cx43表达，抑制异常缝隙连接的形成，达到抗癫疒间形成。

本研究结果显示，与对照组比较，癫疒间组大鼠MDA升高，SOD、GSH-Px降低，说明癫疒间大鼠体内抗氧化/氧化平衡被打破，发生了氧化反应。天麻素干预后癫疒间大鼠 MDA降低，SOD、GSH-Px升高，说明天麻素可以明显改善癫疒间导致的氧化损伤，从而推测天麻素是通过减轻氧化应激水平而起到神经保护作用。同时，天麻素组大鼠较模型组癫疒间发作时大鼠的行为学和脑电图有明显改善，提示天麻素能减轻癫疒间发作的危害程度。

综上所述，癫疒间发病机制非常复杂，除与氧化应激有关外，还有其他方面的因素，而天麻素可能仅从降低氧化应激水平方面缩短癫疒间发作时间，减轻神经元损伤，从而起到保护神经元的作用，但不能完全防治癫疒间的发作。

[1] 李俊,张明,陈夏.抗癫疒间药物与癫疒间患者动脉粥样硬化关系研究进展[J].实用医学杂志,2013,29(5):836-838.

[2] 王千,郝艳秋.抗癫疒间药物长期应用与儿童代谢性骨病[J].国际儿科学杂志,2013,40(4):345-348.

[3] 李智平.戊四氮点燃大鼠慢性癫疒间模型的建立及评价[C].第十届全国儿科药学学术会议,2005:94-98.

[4] Paxinos G,Watson C.鼠脑立体定位图谱[M].北京:人民卫生出版社,2005:1.

[5] Hassanzadeh P,Arbabi E,Rostami F.The ameliorative effects of sesamol against seizures,cognitive impairment and oxidative stress in the experimental model of epilepsy[J].Iran J Basic Med Sci,2014,17(2):100-107.

[6] Calik M,Oguz E,Sarikaya S,et al.An evaluation of serum paraoxonase together with arylesterase activities and oxidative stress in children with intractable epilepsy:A cross-sectional study[J].Epilepsy Res,2014,108(9):1591-1596.

[7] Frantseva MV,Perez Velazquez JL,Tsoraklidis G,et al.Oxidative stress is involved in seizure-induced neurodegeneration in the kindling model of epilepsy[J].Neuroscience,2000,97(3):431-435.

[8] Gulati K,Ray A,Pal G,et al.Possible role of free radicals in theophyl-line-induced seizures in mice[J].Pharmacol Biochem Behav,2005,82(1):241-245.

[9] Eun JP,Choi HY,Kwak YG.Proteomic analysis of human cer-ebral cortex in epileptic patients[J].Experimental and Molecular Medicine,2004,36(2):185-191.

[10]Ilhan A,Aladag MA,Kocer A,et al.Erdosteine ameliorates PTZ-induced oxidative stress in mice seizure model[J].Brain Research Bulletin,2005,65(6):495-499.

[11]姜大景,成祥林,汪华.依达拉奉对癫疒间大鼠脑内谷氨酸的影响[J].中风与神经疾病杂志,2009,5:536-537.

[12]郑慧锋,彭昊.天麻素生物学作用研究进展[J].中国医药,2014,9(11):1726-1728.

[13]林少杰.天麻药理研究进展探析[J].亚太传统医药,2014,10(2):50-51.

[14]穆朝娟,张涛,党雁.天麻素对戊四氮致疒间大鼠的脑保护作用[J].中国中医药科技,2010,17(l):46-47.

[15]Xu X,Lu Y,Bie X.Protective effects of gastrodin on hypoxia-induced toxicity in primary cultures of rat cortical neurons[J].Planta Med,2007,73(7):650-654.

[16]赵燕玲,张博爱,贾延劫,等.天麻素对海人酸致大鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用[J].中国实用神经科杂志,2009,12(5):33-36.

[17]曹亚芹,苏怡凡,陈虹,等.戊四氮致疒间幼鼠颞叶和海马区Cx43的表达及天麻素干预[J].兰州大学学报(医学版),2008,34(3):53-56.

Effect of gastrodin on oxidative stress of hippocampus in epileptic rats

LI Fei,CHENG Xiang-lin*

(Department of Emergency,The First Affiliated Hospital of Yangtze University,Jingzhou 434000,China)

Objective To explore the effect of gastrodin on oxidative stress of hippocampus in epileptic rats induced by pentylenetetrazole(PTZ).Methods 30 adult Wistar rats were randomly divided into normal control(NC)group,epileptic model(PTZ)group and gastrodin (GS)group.The changes of electroencephalogram and ethology of the three groups were observed,and the superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-Px),malondialdehyde(MDA)content were detected by colorimetry.Results Compared with GS group and PTZ group,the activity of SOD and GSH-Px in epilepsy rats reduced,EEG changed,hippocampus increased and MDA content decreased significantly(P<0.01),the seizures degree reduced.Conclusion Gastrodin could increase the SOD and GSH-Px activity in hippocampus of epilepsy rats,inhibit the production of MDA,achieve the antagonistic epilepsy effect by affecting the level of oxidative stress.

Gastrodin;Epilepsy;Pentylenetetrazole;Oxidative stress

2014-09-11

长江大学附属第一医院急诊科，湖北荆州 434000

2013-2014年度湖北省卫生厅科研一般项目(JX6B33)

10.14053/j.cnki.ppcr.201506008

*通信作者