血清中5种维生素水平与阿尔茨海默病相关性研究

朱金峰 党瑞 崔宇 王超 解微 王德才

血清中5种维生素水平与阿尔茨海默病相关性研究

朱金峰 党瑞 崔宇 王超 解微 王德才

目的 基于高效液相色谱法测定阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者血清中维生素A、D3、B1、B2、B12的水平,并探讨与AD的相关性。 方法 采用横断面病例对照研究,测定110例AD患者及130例健康对照血清中维生素A、D3、B1、B2、B12的水平。维生素A、D3测定用甲醇沉淀蛋白,正己烷提取,氮吹浓缩,无水乙醇定容，维生素B1、B2、B12用C18 小柱提取,甲醇/水(80%)定容，高效液相色谱仪紫外检测器(HPLC-UVD)测定。 结果 AD患者血清中维生素A、D3、B1、B2、B12的水平与正常人有显著性差异(P<0.05)。 结论 AD 的发生、转归与维生素A、D3、B1、B2、B12密切相关,提示在预防治疗AD中进行营养干预有一定的实际意义。

维生素; 阿尔茨海默病; 高效液相色谱法

随着社会老龄化迅速发展,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病率急剧上升,严重影响老年人的生活质量,并给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。AD典型的病理学特征为老年斑(senile plaques,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)、神经元减少及颗粒空泡变性等[1]。目前对AD的治疗没有特效药和具体方法,只能是延缓病情的发展。因此采取积极的早期营养干预,预防AD疾病的发生和发展备受关注。该文旨在通过检测AD患者血清中维生素A、D3、B1、B2、B12的水平,探讨5种维生素水平与AD的发生以及病程发展之间的关系,为AD早期的预防治疗及营养干预提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 仪器和试剂 高效液相色谱仪6110(美国Agilent科技有限公司),-80 ℃超低温冰箱,Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司),微型漩涡混匀器, LD5-2A 型台式高速离心机 (北京医用离心机厂),Sep-park C18小柱 (Waters,美国)。

甲醇(色谱纯,山东禹王试剂公司),无水乙醇(分析纯,天津光复试剂有限公司),磷酸二氢钾(分析纯,天津光复试剂有限公司),盐酸(分析纯,天津光复试剂有限公司),维生素A、D3、B1、B2、B12标准品(Sigma,美国)。实验用水为Milli-Q超纯水(>18MΩ/cm)。

1.2 受试对象的选择 采用横断面病例对照研究调查方法,按照美国国立神经病语言障碍卒中研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)诊断标准,以及美国精神医学会的《精神障碍诊断和统计手册》第4版(DSM-Ⅳ)诊断标准,对黑龙江省垦区9个分局64个敬老院,年龄60～100岁老人,由医院专业医师诊断,结合调查问卷结果筛选符合AD标准的患者(病例组)110例,男43例,女67例,平均年龄(77.0±6.3)岁。同时选取在敬老院疗养的健康老人130例为对照组,男65例,女65例,平均年龄(77.0±7.3)岁。所有研究对象均签署知情伦理同意书,自愿参加和退出,自愿接受问卷调查和实验室等与疾病相关的检查。2组间年龄和性别具有可比性。

1.3 受试对象血样采集及保存 用75%医用酒精依次擦拭受试对象采血部位,抗凝管采集受试对象的清晨空腹肘静脉血,4 ℃保存立即带回实验室处理。4 ℃下12000 r/min离心10 min,取上层黄色半透明状液体血清样本,分装后,-80 ℃保存,待测。

1.4 操作步骤

1.4.1 样品前处理:维生素A、D3:从-80 ℃冰箱中取出冷冻血清样品,室温解冻,置涡旋振荡器振荡30 s混匀,取100 μl血清置2 ml离心管中, 加入100 μl 甲醇,涡旋混匀1 min,静置10 min,加入正己烷700 μl,涡旋混匀,12 000 r/min离心10 min,吸取上层正己烷350 μl,氮气吹扫至尽干,加 200 μl无水乙醇复溶,涡旋1 min转入进样瓶中,待测。

维生素B1、B2、B12:将Sep-park C18小柱先后用 6 ml 甲醇和 6 ml 去离子水活化处理。吸取 200 μl血清注入C18小柱内,加压缓慢将血清注入小柱,保留一段时间,用10 ml pH 7.0 磷酸盐缓冲液洗去残留血清和其他杂质,2 ml 甲醇/水(80%)的洗脱液进行洗脱,氮气吹扫至尽干,用0.2 ml 甲醇/水(80%) 定容,转入进样瓶中,待测。

1.4.2 标准曲线的配制:准确称取一定量维生素A、D3的标准品,置于10 ml容量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,浓度为10 μg/ml的储备液,再移取储备液用无水乙醇梯度稀释为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的标准应用液,取100 μl加入进样瓶中待测。

准确称取一定量维生素B1、B2、B12的标准品,置于10 ml容量瓶,用 0.1 mol/L 盐酸溶液配制成10 μg/ml的储备液,再移取储备液用0.1 mol/L 盐酸溶液梯度稀释为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/ml的标准应用液,取100 μl加入进样瓶中待测。

1.4.3 色谱分析条件:本试验通过对不同比例流动相进行筛选,确定最佳色谱条件,见表1。

表1 高效液相色谱最佳色谱分析条件

1.5 测定 在仪器最佳测定条件下,测定不同浓度的标准溶液,同时对处理过的血样测定,以相对保留时间定性,根据标准曲线求得回归方程,计算样品中5种维生素的浓度。

1. 6 数据处理 采用SPSS 17.0统计软件，2组间比较采用独立样本t检验,检测结果以均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义,所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1 检测方法的质量控制

2.1.1 线性范围与检测限:按照标准曲线步骤配制维生素标准应用液,测定5种维生素的检出限、回归方程及相关系数。从表2可见,5种维生素检出限均低于0.207 μg/ml, 相关系数均大于0.999, 表示出良好的线性关系。

2.1.2 回收率及精密度：本试验对方法的准确度和精密度进行了考察,在血清样品中加入高、中、低 3 个浓度的标准物检测,维生素A、D3、B1、B2、B12的回收率分别为(96.167±7.028) %、(95.572±8.593) %、(96.277±8.684) %、(92.911±8.018) %、(91.672±8.087) %;相对标准偏差为(2.767±1.629) %、(2.322±1.625) %、(1.922±1.464) %、(2.678±1.306) %、(2.928±1.057) %,说明该方法具有较好的准确度和精密度。

2.2 2组维生素水平比较 对照组血清中维生素A、D3、B1、B2、B12的含量均高于病例组(P<0.01)。见表3。

表2 5种维生素检出限、回归方程及相关系数

表3 病例组与对照组血清检测结果

注:与病例组比较,**P<0.01

3 讨论

维生素在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用,如果机体长期缺乏维生素,会导致酶的活性降低和抗氧化能力减弱,在一定程度上增加AD病人的氧化应激反应,加重病程的进展,使神经元细胞膜上的不饱和脂肪酸被氧化而产生大量的氧自由基[1],这些氧自由基可以促进Aβ的毒性和聚集,导致神经元退行性病变而加剧AD的病情[2]。超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)是生物体内清除自由基的重要物质[3-4],它们能够消除氧化应激所产生的有害物质O2-和H2O2,阻止过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的生成。本实验研究发现病例组中维生素A明显低于对照组,这可能因为脂溶性维生素A容易进入细胞膜,在细胞膜上发生脂质过氧化反应,淬灭 O2-和H2O2,降低脂质过氧化反应,使抗氧化能力下降。李权超等[5]曾报道维生素A缺乏会导致抗氧化物质SOD 和GSH-Px的含量下降,神经元细胞中的 MDA得不到及时的清除而大量堆积,加重氧化应激反应,增加AD的风险。维生素D3通过神经细胞及神经胶质细胞中的维生素D3受体,直接将25-(OH)D3转变为有活性的1,25-(OH)2D3,提升γ-谷氨酰转肽酶的含量[6],增加还原型谷胱甘肽水平。还原型谷胱甘肽是一种抗氧化剂,能够促进SOD的合成,加速自由基的清除[7]。本实验的结果显示对照组中的维生素D3明显高于病例组,进一步说明维生素D3的缺乏可能会加速AD的进展。维生素B1、B2在氧化代谢平衡方面能够以酶促反应的形式生成还原型谷胱甘肽,维持SOD和GSH-Px的活性[8],降低过氧化物MDA 的含量,减弱氧化应激对机体的损伤,本研究测定AD患者血清中维生素B1、B2的水平均低于对照组,说明维生素B1、B2的缺乏可能会使AD患者脑内氧化代谢异常,还原型谷胱甘肽水平降低,细胞膜脂质过氧化加重,过氧化物MDA得不到及时的清除而大量堆积,致使AD患者病情进一步加重。维生素B12是蛋氨酸合成酶的辅酶,可催化同型半胱氨酸(Hcy)甲基化生成蛋氨酸的反应,期间必须有5-四氢叶酸作为甲基供体,如果体内缺乏维生素B12,5-甲基四氢叶酸上的甲基不能转移,阻碍蛋氨酸的生成,从而造成Hcy在体内的蓄积,Hcy可通过激活离子型或代谢型谷氨酸受体,引起大量的钙离子内流,致使钙超载,损伤线粒体,导致细胞氧化代谢功能障碍。Hcy还可以抑制GSH-Px、SOD的活性,减少活性氧的清除[9],提高脑神经细胞对Aβ的敏感性,导致AD患者学习和记忆的神经元死亡[10]。本研究病例组维生素B12含量显著低于对照组,说明维生素B12的缺乏会间接地导致AD患者脑内氧化应激反应的加重。

综上所述,人体内维生素A、D3、B1、B2、B12的缺乏可造成认知功能障碍和记忆损伤,引起中枢神经系统退行性疾病,其协同作用与AD疾病的发生和发展密切相关,因此,采用复合维生素对AD进行早期预防和干预，对提高机体抗氧化能力,减轻氧化应激对脑神经细胞的损伤,改善认知功能,预防AD的发生,延缓病情的进展具有现实意义。

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Relationship of the levels of 5 kinds of vitamin in serum with Alzheimer’s disease

ZHUJin-feng,DANGRui,CUIYu,WANGChao,XIEWei,WANGDe-cai.PublicHealthCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China

Objective To investigate the levels of vitamin A, D3, B1, B2and B12in the serum of patients with Alzheimer’s disease (AD), and to investigate the correlation with AD. Methods A cross-sectional case control study was conducted. Methanol, hexane extraction, nitrogen concentration and ethanol volume were utilized in Vitamin A, D3for the pretreatment of samples. Vitamin B1, B2, B12were extracted with C18 column, and the volume was controlled with methanol/water (80%). The determination was performed by high performance liquid chromatography with ultraviolet detector (HPLC-UVD). Results The levels of vitamin A, D3, B1, B2, B12in the patients with AD were significantly lower than those in healthy controls (P< 0.05). Conclusions The occurrence and prognosis of AD are closely related with the levels of vitamin A, D3, B1, B2, B12. Nutritional intervention might be helpful for the prevention and treatment of AD.

vitamin; Alzheimer’s disease; high performance liquid chromatography

国家自然科学基金资助项目(81273193)

150081黑龙江省哈尔滨市，哈尔滨医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室

王德才，Email：decaiwang@live.cn

R 749.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.012

2014-08-29)