一测多评法同时测定苍柏祛痛胶囊中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量*

刘鸿雁，吴 晶，刘丽娜，袁文珺，吴丹枫，贾 忠，△

1兰州市肺科医院，甘肃 兰州 730046；2甘肃农业大学；3兰州市中医医院

一测多评法同时测定苍柏祛痛胶囊中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量*

刘鸿雁1，吴 晶2，3，刘丽娜1，袁文珺3，吴丹枫2，贾 忠1，2△

1兰州市肺科医院，甘肃 兰州 730046；2甘肃农业大学；3兰州市中医医院

目的：建立苍柏祛痛胶囊中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的一测多评含量测定方法。方法：采用反相H PLC法，色谱柱：W at ers X SELECTCSH-C18(4.6 m m×150 m m，5.0 μm)；柱温：30℃；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱；流速1.0 m L/m i n；紫外检测波长284 nm。以盐酸小檗碱为对照，建立盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱之间的校正因子，计算盐酸黄柏碱的含量。分别采用外标法和一次多评法测定苍柏祛痛胶囊中盐酸黄柏碱的含量，将两种方法测定结果进行比较。结果：6批药品一测多评法的计算值和外标法测定值间无显著差异，实验所得的相对校正因子可信。结论：用一测多评法对苍柏祛痛胶囊进行质量控制是可行的、准确的。

苍柏祛痛胶囊；高效液相色谱法；一测多评法；盐酸小檗碱；盐酸黄柏碱；校正因子

“苍柏祛痛胶囊”源于甘肃省名老中医贾奇峰的经典验方“痛风散”，主要由黄柏、苍术、川牛膝、防己等14味药组成，多年来运用于痛风的临床治疗，具有清热利湿，祛瘀降浊，通络止痛之效，能够缓解痛风急性发作期的红、肿、热、痛等症状，还可控制痛风患者血尿酸水平，达到防止痛风复发的目的［1-6］。方中以黄柏、苍术为君药，黄柏碱为黄柏中的特有成分，小檗碱为黄柏生物碱中含量较高的成分［7-8］，因此，本研究以黄柏碱及小檗碱作为质量评价指标，确定最佳含量测定方法，既能较好地反映其质量又具有专属性，能更加有效地控制该中药处方的质量。

1 材料

1.1 材料 色谱纯乙腈(山东禹王实业有限公司化工分公司生产，批号：20130514278)；磷酸(天津市富宇精细化工有限公司生产，批号：090919)；纯化水。对照品盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱(批号：110713-201212、111895-201202)均购自中国食品药品鉴定研究院；苍柏祛痛胶囊样品(兰州市肺科医院制剂室生产，批号：20131218、20140121、20140226、20140312、20140415、20140513)。

1.2 仪器 Waters 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；FA2004B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；KH-500DE数控超声波清洗器(功率250 W，频率50 kHz，昆山禾创超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱：Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm×150 mm，5.0 μm)；流速：1.0 mL/min；检测波长：284 nm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱，0～15分钟乙腈比例(10→18)，15～25分钟乙腈比例(18→40)。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品适量，加乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)制成每1 mL含盐酸小檗碱42.24 μg、盐酸黄柏碱75.2 μg的溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 参考《中国药典》2010版一部黄柏含量测定项下方法［9］，取本品约2.0 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈-0.1%磷酸水(36∶64) 25 mL，称定重量，超声处理30分钟(功率250 W，频率50 kHz)，放冷，再称定重量，用乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺黄柏药材的阴性样品2.0 g，按“2.2.2”项下方法制成阴性供试品溶液，备用。

2.3 线性关系的考察 取盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)制成每1 mL含盐酸小檗碱42.24μg、盐酸黄柏碱75.20 μg的混合溶液，摇匀，作为储备液。精密吸取上述储备溶液 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)稀释至刻度，微孔滤膜滤过，取续滤液，各进样10 μL，测定峰面积，以对照品峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程、相关系数及线性范围，见表1。

表1 标准曲线回归方程

2.4 精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定色谱峰的峰面积，盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱的RSD分别为0.61%、1.34%，结果表明精密度良好。

2.5 校正因子的计算 根据校正因子的计算公式fk/m=fk/fm= (Wk×Am)/(Wm×Ak)［10-11］，以黄柏中盐酸小檗碱为内标，建立其与盐酸黄柏碱之间的校正因子，通过校正因子计算盐酸黄柏碱的含量。式中Ak为内标物峰面积，Wk为内标物的质量；Am为待测组分m的峰面积；Wm为待测组分m的质量。在实际测定时，用外标法测定盐酸小檗碱的含量，再通过校正因子计算盐酸黄柏碱的含量，同时用常规外标法进行同步测定，以验证计算值的正确性和可行性。根据以上公式，结合对照品溶液的不同进样量所得峰面积数据，以盐酸小檗碱为内标，计算盐酸小檗碱对盐酸黄柏碱的校正

因子(fk/m)，见表2。

表2 校正因子计算相关数据

2.6 稳定性实验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、12小时进样，测定色谱峰的峰面积，得盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱峰面积的RSD值分别为0.79%、1.23%，结果表明在0～12小时内稳定性良好。

2.7 重复性实验 取同一批号样品5份，按照样品制备方法进行样品处理，分别进样测定，得到盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱总量的RSD分别为0.44%、0.71%、0.64%，结果表明该方法重现性较好。

2.8 回收率实验 取已知含量的同一批号样品(盐酸小檗碱0.695 0 mg/g，盐酸黄柏碱0.077 2 mg/g)粉末约1.0 g，精密称定，加入一定量的盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱，依法测定，根据色谱峰峰面积值，分别求得盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱的含量，计算回收率，得到RSD分别为1.05%、0.95%，结果表明，本法回收率好，见表3。

2.9 样品的测定 取6批苍柏祛痛胶囊样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL进样，按上述色谱条件测定，分别计算盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱的含量，见表4。

2.10 校正因子的系统适应性考察

2.1 0.1 不同色谱柱及高效液相色谱仪考察 取“2.3”项下混合对照品溶液，按照“2.1”项色谱条件，依次进样1、5、10、20 μL，按“2.7”项下计算盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱之间的校正因子。考察Waters 2695，Agilent 1100两种高效液相色谱系统和XSelect HSS C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，XSelect CSH-C18column (150 mm×4.6 mm，5 μm)，及Symmetry C18column(150 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱，结果见表5。

表3 回收率结果

2.1 0.2 待测组分色谱峰的定位 “内标校正法”在实际应用中利用相对校正因子计算含量，无需用组分的色谱峰进行定位。对于成分复杂的样品，色谱图中除待测组分色谱峰外，还存在多个其他色谱峰，因此，对待测组分色谱峰的正确定位是准确测定的前提。利用相对保留值定位：知道内参物的保留时间，加上相对保留值，再根据峰形判断，即能正确判断出目标峰的准确峰位置，结果RSD＜1%，表明利用相对保留时间进行峰的定位是可行的，见表6。

2.1 0.3 内标校正法测定样品含量 取6批样品，精密称取约2.0 g，按“2.3”项下操作，制成供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液进样分析，测定。采用外标法和内标校正法计算样品中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量，得到RSD＜3%，见表7。

表7 用外标法和内标校正法所测样品中盐酸小檗碱及盐酸黄柏碱含量

3 讨论

3.1 提取溶剂、方法及提取时间的选择 根据生物碱类成分的性质，考察甲醇、乙腈、乙腈-0.1%磷酸水等提取溶剂，采用超声、回流法提取，选择出最佳提取方法为乙腈-0.1%磷酸水(36∶64)超声提取30分钟。

3.2 检测波长的选择 采用PDA检测器在200～400 nm扫描，综合考虑盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的吸收光谱，使2组分均有较大吸收，选用284 nm为检测波长。

3.3 流动相的选择 为保证各指标成分得到良好分离，考察甲醇-水系统，乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等度系统及梯度系统，结果采用乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脱系统两个成分得到了良好分离，各峰之间的分离度均大于1.5，所建立的方法简单、快捷、准确，为苍柏祛痛胶囊质量标准的研究提供了依据。

本实验首次对苍柏祛痛胶囊中的主要有效成分盐酸小檗碱及盐酸黄柏碱进行了含量测定，由于盐酸黄柏碱含量较低且在液相中相应值很低，限制了这一主要活性成分的含量测定。本研究建立了盐酸小檗碱及盐酸黄柏碱间的相对校正因子，在测定盐酸小檗碱含量的基础上，利用该校正因子对盐酸黄柏碱进行含量换算，结果表明该方法测得盐酸黄柏碱的含量与外标法测得盐酸黄柏碱含量无显著性差异。本研究为制剂中黄柏药材的定量控制，为苍柏祛痛胶囊的质量评价提供新的方法，同时为苍柏祛痛胶囊的进一步质量标准研究工作提供了依据。

［1］ 王峥涛.中药质量标准研究进展与展望［J］.中国天然药物，2006，4(6)：403-410.

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［4］ 王智民，高慧敏，付雪涛，等.“一测多评”法中药质量评价模式方法研究［J］.中国中药杂志，2006，31(23)：1925-1928.

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［6］ 周松，刘永刚，张国祥，等.黄柏化学成分及质量控制研究进展［J］.中国药房，2012，23(39)：3740-3742.

［7］ 张莉，潘超.高效液相色谱法同时测定二妙丸中盐酸小檗碱和黄柏碱的含量［J］.中国新药杂志，2011，20(22)：2262-2264.

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Determination ofBerberine Hydrochloride and Phellodendrine Hydrochloride in CangBai QuTong Capsules Simultaneously by Quantitative Analysis ofMulti-components by Single Marker

LIU Hongyan1,WU Jing2,3,LIU Lina1,YUAN Wenjun3,WU Danfeng2,JIA Zhong1,2△
1 Lanzhou Municipal Lung Hospital,Lanzhou 730046,China;
2 Gansu Agricultural University;3 Lanzhou Municipality TCM Hospital

Objective:To establish the method of quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS)for determining berberine hydrochloride and phellodendrine hydrochloride in CangBai QuTong capsules. Methods:Reversed HPLC method was adopted,chromatographic column:Waters XSELECT CSH-C18(4.6 mm× 150 mm,5.0 μm);column temperature:30℃;mobile phase:acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution,gradient elution;flow rate:1.0mL/min;UV detection wavelength:284 nm.Berberine hydrochloride was taken as the control, correction factors between berberine hydrochloride and phellodendrine hydrochloride were established to calculate the contents of phellodendrine hydrochloride.The contents of phellodendrine hydrochloride in CangBai QuTong capsules were determined by external standard method and QAMS,and the results were compared.Results:The values of QAMS were compared with the ones of external standard method in six batches of the herbs,and there was no significant difference,obtained relative correction factor(RCF)was credible in the experiments.Conclusion:It is feasible and accurate for quality control of CangBai QuTong capsules by QAMS.

CangBai QuTong capsules;HPLC;quantitative analysis of multi-components by single marker; berberine hydrochloride;phellodendrine hydrochloride;correction factors

R917.1

A

1004-6852(2015)11-0023-04

2015-05-09

甘肃省中医药科学技术研究课题(编号G ZK-2012-55)；兰州市人才创新创业科技计划项目(编号2014-RC-70)。

刘鸿雁(1979—)，女，硕士学位，主管药师。研究方向：药物鉴别和分析。

△通讯作者：贾忠(1964—)，男，硕士学位，主任药师。研究方向：医院药学和新药开发。