新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞TGF-β/Smads信号通路的影响*

程 涛，权 卓，杨丽霞，田广芳，张定华，刘铜华

1甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；2中国解放军第十医院；3甘肃省中医院；4北京中医药大学

新加糖肾康对高糖环境下HK-2细胞TGF-β/Smads信号通路的影响*

程 涛1，权 卓2，杨丽霞1，田广芳3，张定华3，刘铜华4

1甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；2中国解放军第十医院；3甘肃省中医院；4北京中医药大学

目的：通过观察新加糖肾康（TSK）对高糖环境培养下人肾小管上皮细胞（H K-2）TG F-β/Sm ads信号通路的影响，探讨其防治糖尿病肾病的作用机制。方法：体外培养H K-2细胞，培养基为含10%胎牛血清的1640培养基，实验分为6组：空白对照组、高糖组（30 m m ol/LD-葡萄糖）、空白血清对照组（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%空白血清）、新加糖肾康低剂量组（30 m m ol/L D-葡萄糖+5%TSK药物血清）、新加糖肾康中剂量组（30 m m ol/LD-葡萄糖+10%TSK药物血清）、新加糖肾康高剂量组（30 m m ol/LD-葡萄糖+20%TSK药物血清）。ELISA法检测转化生长因子-β1（TG F-β1）、转化生长因子-β受体I（TG F-βRⅠ）、转化生长因子-β受体Ⅱ（TG F-βRⅡ）、Sm ad2、Sm ad3的表达。结果：H K-2细胞经高糖环境培养后TG F-β1、TG F-βRⅠ、TG F-β RⅡ、Sm ad2、Sm ad3的含量显著增加，与空白对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。但经新加TSK干预后其含量下降，与高糖组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：中药复方TSK能够抑制肾小管上皮细胞TG F-β/Sm ads信号通路，具有防治糖尿病肾间质纤维化的作用。

新加糖肾康；高糖；人肾小管上皮细胞；TG F-β/Sm ads通路

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症之一，其发病率高，危害大，在糖尿病所有并发症中占主要地位，直接关系着糖尿病患者的生活质量。截至目前，国内外进行了大量DN的研究，但对其发病机制尚未完全解释清楚。近年研究发现，肾间质纤维化与DN密切相关［1］。因此，通过干预肾间质纤维化预防DN的研究逐渐兴起，特别是有关中医药的研究越来越多。

中药复方新加糖肾康是在甘肃省中医院刘国安和张定华主任医师研究的基础上，结合北京中医药大学刘铜华教授治疗DN的学术思想［2-3］，经过组方优化，最终确立的临床经验方，全方具有“益气养阴，清热祛湿，活血化瘀”的功效。前期临床研究发现，糖肾康对2型糖尿病患者血液流变学指标具有一定的改善作用，并能减少尿微量白蛋白，对DN患者具有较好的临床疗效。本课题组前期研究发现，新加糖肾康能够减少高糖环境培养下人肾小管上皮细胞的细胞外基质成分Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的分泌与沉积，并能调控纤维化因子基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)及其抑制剂-1(TIMP-1)的分泌与释放［4-5］。本课题在此研究基础上，继续观察其对高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞TGF-β/Smads信号通路的影响，进一步揭示其治疗DN的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞株 SPF级雄性Wistar大鼠20只，体质量(200±20)g，购于甘肃中医学院动物中心，许可证号：SCXK(甘)2011-0001，饲养于甘肃省中医药研究院中药研究所动物室。人肾小管上皮细胞株(HK-2)购于上海斯信生物科技有限公司，培养于甘肃省中医药研究院中心实验室细胞培养室中。

1.2 药品与试剂 1640培养基(Gibco公司，批号：1237579)；胎牛血清(Gibco公司，批号：12657-029)。人TGF-β1ELISA试剂盒(批号：E9372Hu)；TGF-β RⅠELISA试剂盒 (批号：E3571Hu)；TGF-β RⅡELISA试剂盒(批号：E3572Hu)；Smad2 ELISA试剂盒(批号：E2911Hu)；Smad3 ELISA试剂盒(批号：E2912Hu)，生产厂家均为上海晶天生物科技有限公司。D-葡萄糖(汕头西陇化工厂有限公司，批号：0810142)，用时配成30 mmol/L的浓度［6］。新加糖肾康所用中药材购于甘肃省中医院药剂科，主要组成有黄芪、生地黄等药材，用时水提醇沉，冷藏备用。

1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(型号：MCO-18AIC，厂家：SANYO，日本)；超净生物安全柜(型号：SW-CJ-2FD，厂家：苏净安泰，中国)；倒置显微镜(型号：IX51，厂家：Olympus，日本)；酶标仪(型号：MS 352，厂家：Labsystems，芬兰)；-80℃超低温冰箱(型号：MDF-U53V，厂家：SANYO，日本)；立式灭菌器(型号：LMQ.CV，厂家：山东新华，中国)。

1.4 方法

1.4.1 新加TSK药物血清制备方法 20只雄性Wistar大鼠随机分为：空白组和药物组，每组10只。药物组采用新加TSK灌胃，剂量为成人临床用量的6.5倍；空白组采用同体积生理盐水灌胃。每次灌胃体积为0.01 mL/g(体质量)。早、晚各1次，持续3天。最后1次灌胃前禁食，不禁水，在灌胃30分钟后，大鼠股动脉无菌采血，冷冻离心吸取血清，装入EP管中，-20℃保存备用。

1.4.2 H K-2细胞培养及实验分组 HK-2细胞培养于37℃、5%CO2培养箱中，培养基为含10%胎牛血清的1640培养基。每天在显微镜下观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，待细胞生长融合达到80%以上，用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化，显微镜下观察细胞消化程度，及时拍落消化的细胞，用完全培养基终止消化，低速离心5分钟，用新鲜培养基将细胞吹打均匀后进行传代培养。实验分为6组，空白对照组：1640培养液培养；高糖组：在1640培养液中加入30 mmol/L D-葡萄糖，对细胞进行高糖环境下培养；空白血清对照组：在高糖组的基础上，加入10%空白血清，对细胞进行干预性培养；新加糖肾康低、中、高剂量组：在高糖组的基础上，分别加入5%、10%、20%新加TSK药物血清，对细胞进行干预性培养。

1.4.3 指标检测 采用ELISA法检测细胞培养上清中TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量。

1.4.3.1 样本制备 将传代培养的细胞吹打均匀，接种在24孔细胞培养板中，剂量为1 mL，每组3孔，接种2板。2小时后在显微镜下观察细胞贴壁状态。培养24小时后吸弃上清。每组加入1 mL含药培养液，继续培养。培养24、48小时，仔细吸取每孔细胞上清于1.5 mL的EP管中，4℃离心，取上清，低温保存待测。

1.4.3.2 指标检测方法 按照ELISA试剂盒说明书进行。检测前将样本置室温慢慢融化，在反应条孔中加入标准品或待测标本，每孔剂量为100μL。在空白对照孔加入100 μL稀释液。在37℃培养箱中孵育，孵育后洗涤反应板，最后加酶标抗体进行酶联免疫反应。反应终止后，以空白对照孔调零，在酶标仪450 nm处测定各孔OD值。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析，计量资料以(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组HK-2细胞经ELISA检测后显示：正常培养的HK-2细胞经高糖培养24、48小时后，TGF-β/ Smads信号通路上的蛋白分子TGF-β1、TGF-β RⅠ、TGF-β RⅡ、Smad2和Smad3的含量显著增加，高糖培养48小时时，各蛋白分子的含量更多，与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；但在新加TSK干预性培养后，其含量开始减少，并且随着药物剂量的增加及作用时间的延长，药效逐渐加强，特别是在药物高剂量、作用48小时时，效果更为明显，与高糖组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。而空白血清对照组则无此作用。结果表明，新加TSK能够抑制高糖环境下人肾小管上皮细胞TGF-β/Smads信号通路，在一定程度上抑制了糖尿病肾间质纤维化的发展，见表1—5。

表1 各组H K-2细胞不同时间TG F-β1的含量比较(±s) ng/L

表1 各组H K-2细胞不同时间TG F-β1的含量比较(±s) ng/L

注：*表示与空白对照组相比，P＜0.05；△表示与高糖组相比，P＜0.05。

组别 只数 24 h 48 h空白对照组 3 29.344±8.770 30.866±2.616高糖组 3 94.144±5.001*111.921±2.377*空白血清对照组 3 29.942±3.218△28.093±4.625△新加糖肾康低剂量组 3 90.502±7.529*76.041±1.876*△新加糖肾康中剂量组 3 88.056±11.137*77.564±1.876*△新加糖肾康高剂量组 3 83.652±8.781*72.671±7.195*△

表2 各组H K-2细胞不同时间TG F-β RⅠ的含量比较(±s) ng/L

表2 各组H K-2细胞不同时间TG F-β RⅠ的含量比较(±s) ng/L

注：*表示与空白对照组相比，P＜0.05；△表示与高糖组相比，P＜0.05。

组别 只数 24 h 48 h空白对照组 3 442.954±72.263 485.661±17.491高糖组 3 848.671±101.098*1070.881±21.592*空白血清对照组 3 436.948±70.066△404.918±50.526△新加糖肾康低剂量组 3 755.916±58.342*707.204±50.048*△新加糖肾康中剂量组 3 683.848±79.506*695.192±46.174*△新加糖肾康高剂量组 3 609.111±69.722△497.005±86.268△

表3 各组H K-2细胞不同时间TG F-β RⅡ的含量比较(±s) ng/L

表3 各组H K-2细胞不同时间TG F-β RⅡ的含量比较(±s) ng/L

注：*表示与空白对照组相比，P＜0.05；△表示与高糖组相比，P＜0.05。

组别 只数 24 h 48 h空白对照组 3 402.842±49.284 367.093±28.694高糖组 3 712.308±25.727*845.698±61.127*空白血清对照组 3 344.684±46.457△370.828±70.212△新加糖肾康低剂量组 3 625.870±19.297*558.642±31.786*△新加糖肾康中剂量组 3 620.535±95.894*546.370±51.181*△新加糖肾康高剂量组 3 480.208±25.926△417.248±52.188*△

表4 各组H K-2细胞不同时间Sm ad2的含量比较(±s) ng/L

表4 各组H K-2细胞不同时间Sm ad2的含量比较(±s) ng/L

注：*表示与空白对照组相比，P＜0.05；△表示与高糖组相比，P＜0.05。

组别 只数 24 h 48 h空白对照组 3 273.212±17.254 370.347±49.673高糖组 3 657.410±13.259*841.368±56.214*空白血清对照组 3 332.361±65.145△344.300±49.163△新加糖肾康低剂量组 3 619.424±50.151*586.322±52.860*△新加糖肾康中剂量组 3 554.306±60.014*558.647±75.666*△新加糖肾康高剂量组 3 458.256±27.192*△373.603±46.589△

表5 各组H K-2细胞不同时间Sm ad3的含量比较(±s) ng/L

表5 各组H K-2细胞不同时间Sm ad3的含量比较(±s) ng/L

注：*表示与空白对照组相比，P＜0.05；△表示与高糖组相比，P＜0.05。

组别 只数 24 h 48 h空白对照组 3 277.418±19.498 350.608±39.562高糖组 3 692.518±57.764*837.829±35.706*空白血清对照组 3 371.443±55.527△316.417±92.657△新加糖肾康低剂量组 3 564.836±86.995*570.712±74.538*△新加糖肾康中剂量组 3 534.919±46.955*517.823±23.610*△新加糖肾康高剂量组 3 425.401±29.085△406.169±30.296△

3 讨论

近年研究认为，糖尿病肾病(DN)的形成与发展与肾间质纤维化密切相关。肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是所有肾脏疾病发展进行到终末期的共同病理改变的基础。其形成与多种病理因素相关，最为常见的有高血压、高血糖、蛋白尿、氧化应激及各类纤维化因子等。这些病理因素通过特定的信号通路引起肾小管上皮细胞转分化，致使上皮细胞的形态发生改变，成为另一种新的细胞。肾小管上皮细胞转分化后，主要变为肌成纤维细胞，这是细胞外基质成分的主要来源，也是纤维化形成的主要特征［7］。因此，干预肾小管上皮细胞转分化、抑制肾间质纤维化成为防治DN的主要途径。

肾小管上皮细胞转分化过程中起关键作用的是TGF-β，已被公认为纤维化最主要的诱导因子，且其他细胞因子均通过调节TGF-β的表达来发挥作用。Yang等［8］研究报道，在大鼠单侧输尿管梗阻模型中，TGF-β1参与了纤维化的发展过程，诱导了肾小管上皮细胞转分化。Fan等［9］报道，在鼠肾小管上皮转分化中，纤维化程度随着TGF-β剂量的增加而增强。TGF-β诱导纤维化的作用主要通过Smads信号通路来实现［10］，止消通脉宁和糖耐康干预糖尿病肾病肾间质纤维化也证实了这一观点［11-12］。本研究发现，在高糖环境下人肾小管上皮细胞TGF-β1的含量显著增加，其受体TGF-β RI、TGF-β RII的含量以及下游信号分子Smad2、Smad3的含量均显著增强，与既往报道基本一致，说明Smads信号通路激活是糖尿病肾间质纤维化的机制之一。因此，抑制TGF-β/Smads信号通路是干预肾小管上皮细胞转分化的关键。

目前关于肾间质纤维化的治疗缺乏有效措施，许多研究仍处在初级阶段，西医研究主要集中在TGF-β中和抗体或天然拮抗剂及基因治疗等方面，这些研究成本高，期限长，缺乏临床实践基础，药物应用前景难以预测。近年来，中医药在该方面的研究越来越多，从化浊排毒、清热利湿、活血化瘀等多个角度开展了很多抗纤维化的基础研究及临床研究，涉及临床观察、动物实验、细胞实验，并取得了较好的研究效果［13］。

DN属中医“消渴”兼“肾病”范畴。古代医家认为：消渴日久，脏腑气血虚衰，水湿痰浊内停，瘀血阻络，发为水肿尿甜。基本病机特点为“本虚标实”。本课题所选中药复方新加糖肾康，由生黄芪、地黄等中药组成，方中黄芪、生地黄益气养阴，为君药；槐米、大黄清热祛湿，为臣药；益母草、山楂、水蛭活血化瘀，为佐药。其中水蛭为新增虫类药，加强了组方的活血化瘀作用。全方具有“益气养阴，清热祛湿，活血化瘀”的功效，符合DN“本虚标实”的理论基础。本研究发现，新加糖肾康能够抑制高糖环境培养下人肾小管上皮细胞TGF-β1超表达，进而抑制了TGF-β RI、TGF-β RII的表达，继而抑制了其信号通路分子Smad2、Smad3的表达，最终抑制了肾间质纤维化的信号转导，阻止了纤维化的发展，这可能是其防治糖尿病肾间质纤维化的分子机制之一。

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［3］ 杨丽霞.刘铜华教授中医诊治糖尿病肾病的学术思想［J］.国际中医中药杂志，2008，30（5）：385-386.

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［11］杨丽霞，舒畅，吴丽丽，等.糖耐康对TG F-β1诱导的H K-2细胞Sm ads信号通路的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（20）：160-163.

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［13］杨丽霞，黄宗涛，刘铜华，等.中药复方防治肾纤维化的实验研究概况［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：211-213.

Influence of XinJia TangShenKang on TGF-β/Smads Signal Channel of HK-2 Cells in High Concentrations of Glucose

CHENG Tao1,QUAN Zhuo2,YANG Lixia1,TIAN Guangfang3,ZHANG Dinghua3,LIU Tonghua4
1 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China;
2 The Tenth Hospital of Chinese PLA;
3 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine;4 Beijing University of Chinese Medicine

Objective:To explore the mechanism of XinJia TangShenKang (TSK)in treating diabetic nephropathy by observing its effects on TGF-β/Smads signal channel of human renal tubular epithelial cells HK-2 in high concentrations of glucose.Methods:HK-2 cells were cultivated in 1640 culture media containing 10%fetal bovine serum,they were randomized into six groups:blank control group,high glucose group (30 mmol/L D-glucose),the control group of blank serum (30 mmol/L D-glucose+10%blank serum),low dose (30 mmol/L D-glucose+5%TSK medicated serum),moderate dose(30 mmol/L D-glucose+10%TSK medicated serum)and high dose(30 mmol/L D-glucose+20%TSK medicated serum)groups of TSK.ELISA method was used to detect the expressions of TGF-β1,TGF-β RⅠ,TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3.Results:The contents of TGF-β1,TGF-β RⅠ, TGF-β RⅡ,Smad2 and Smad3 increased significantly after HK-2 cells cultivated in high concentrations of glucose, it had significant difference compared with blank control group(P＜0.05).The contents of these indexes decreased after intervened with XinJia TSK,and it had significant difference compared with high glucose group(P＜0.05). Conclusion:The compound TSK could inhibit TGF-β/Smads signal channel of HK-2,it could prevent and treat diabetic renal interstitial fibrosis.

XinJia TangShenKang;highglucose;humanrenaltubularepithelialcells;TGF-β/Smadssignalchannel

R587.1

A

1004-6852(2015)11-0013-04

2015-05-07

甘肃省中医药管理局中医药科学技术研究课题（编号G ZK-2011-13）。

程涛(1971—)，男，副主任医师。研究方向：中医内科学。