解毒化浊方对胰岛素抵抗大鼠GLUT4m RNA表达的影响*

杨维杰，康学东，朱 瑾，余臣祖，王苑铭，安小平，张瀚文

甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

解毒化浊方对胰岛素抵抗大鼠GLUT4m RNA表达的影响*

杨维杰，康学东△，朱 瑾，余臣祖，王苑铭，安小平，张瀚文

甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

目的：探讨解毒化浊方对胰岛素抵抗大鼠葡萄糖转运4(glucose transporter 4,GLUT4)表达的影响及其治疗胰岛素抵抗的作用机理。方法：将雄性wistar大鼠48只随机选出12只设为空白组，采用生理盐水灌胃，其余大鼠采用高脂饲料喂养方法造胰岛素抵抗大鼠模型后，随机分为模型组、解毒化浊治疗组及罗格列酮治疗组，每组12只，解毒化浊组以解毒化浊方混悬液2.025g/（kg·d）灌胃，罗格列酮组以罗格列酮混悬液0.36mg/（kg·d）灌胃，模型组与空白对照组均予等体积生理盐水灌胃。治疗10周后检测大鼠空腹血糖（FBG）、糖耐量试验（2 h血糖）［OGTT（2hPG）］、空腹胰岛素(FINS)水平，并应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测各组大鼠骨骼肌组织GLUT4 mRNA的水平。结果：解毒化浊方与罗格列酮均能降低大鼠FBG、2hPG及FINS水平，差异有统计学意义（P＜0.05），在降低体质量方面与空白组比较解毒化浊组及罗格列酮组差异有统计学意义（P＜0.05）；解毒化浊组与罗格列酮组大鼠血清FBG、2hPG、FINS比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组比较，模型组大鼠GLUT4表达水平呈低表达（P＜0.05）；与模型组比较，解毒化浊组与罗格列酮组大鼠GLUT4表达水平显著增加（P＜0.05）。结论：解毒化浊方可降低胰岛素抵抗大鼠血清FBG、OGTT（2hPG）及FINS水平，增加骨骼肌组织中GLUT4的表达，提高胰岛素敏感性，有改善胰岛素抵抗的作用。

胰岛素抵抗；解毒化浊方；激酶葡萄糖转运子4

胰岛素抵抗（In su l in R e s i s tan c e，I R）是指胰岛素作用的靶器官、组织(主要肝脏、骨骼肌、脂肪组织)对胰岛素敏感性降低的一种异常状态，即需要高于正常剂量的胰岛素才能产生正常的生理效应。研究表明，I R是一种重要病理生理变化，不仅是肥胖、糖尿病、高血压、动脉硬化性心血管疾病、脂质代谢异常等的共同危险因素[1]，而且还与妊娠、肿瘤、感染、应激等多种生理或病理有着密切关系。随着人民生活水平的提高、饮食结构及生活方式的改变，长期高脂饮食使得肥胖的发病率增高，而因肥胖引起胰岛素抵抗的患病率日趋增高。长期高脂环境能损害包括骨骼肌、肝脏和脂肪在内的多种胰岛素靶器官的胰岛素敏感性。因此，高脂饮食已成为诱发胰岛素抵抗(I R)的独立危险因素之一[2]。近几年胰岛素抵抗的研究已经成为国际学术界研究的焦点。因此，本研究拟观察解毒化浊方对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌组织胰岛素信号通路中G L U T4表达的影响，探讨其治疗胰岛素抵抗的作用机理，为中医药防治胰岛素抵抗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 由甘肃中医药大学实验中心S P F级动物实验室提供S P F级W i s tar大鼠48只［4月龄，体质量（200±20）g，雄性］；动物实验使用证号：S YX K(甘)2011-0001-0000407；实验动物合格证号：S C X K(甘)2011-0001-0001365。予普通饲料适应性喂养1周。

1.1.2 实验药物与试剂 普通饲料为S P F级大鼠普通饲料，由甘肃中医学院S P F动物实验中心提供；高脂饲料配方比例为（猪油10%∶胆固醇2%∶胆酸盐0.5%∶蔗糖20%∶普通饲料67.5%），由北京科澳协力饲料有限公司定制；大鼠血清胰岛素检测试剂盒（R at I N S EL IS A K it，甘肃宝信生物技术公司提供）；D EPC（天津鼎天生物科技有限公司，Si g ma分装，批号：D5758）；S Y B R G reen（瑞士罗氏公司）；R na s e-f ree水（北京百泰克生物科技有限公司）；高纯总R N A快速提取试剂盒、荧光实时定量PC R试剂盒及反转录试剂盒均购自日本T a k ara中国宝生物工程（大连）有限公司，产品代码分别为 S D1410、RR036、RR820A；引物合成［大鼠G L U T4基因的特异性引物序列由日本T a k ara中国宝生物工程（大连）］有限公司设计并合成；解毒化浊方药物组成：黄连、黄柏、鸡内金、山楂、枳壳、丹参，按一定比例配伍而成，用水提法提取，浓缩、干燥、制粒。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立与分组 将48只雄性W i star大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组，即空白组12只、造模组36只，造模组采用高脂饲料喂养4周的方法造模，空白组给予普通饲料，4周后通过测定大鼠体质量、空腹血糖、糖耐量试验（O G TT）2 h血糖、胰岛素敏感性｛ISI：ln[1/(F B G× I N S)]｝[3]将造模成功大鼠随机分为模型组、解毒化浊组及罗格列酮组，解毒化浊组以解毒化浊方混悬液2.025 g/（k g·d）灌胃；罗格列酮组以罗格列酮混悬液0.36m g/（k g·d）灌胃，模型组与空白组均予等体积的生理盐水灌胃。每组持续给药10周。

1.2.2 实验指标检测 10w后禁食12 h，空腹称重；同时检测大鼠尾静脉空腹血糖（F B G）、O G TT（2 h）血糖；O G TT检测结束后所有大鼠按剂量3 m L/k g用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取血，测空腹血清胰岛素(F I N S)，计算胰岛素敏感性(ISI)；并取一侧后肢骨骼肌，装入冻存管中，迅速冻存于液氮中，24 h后置于-80℃低温冰箱保存；之后用R T-PC R技术检测胰岛素抵抗大鼠骨骼肌组织G L U T4 m R N A表达。T ri z ol试剂提取骨骼肌总R N A，行完整性和纯度鉴定，并依A260值进行定量。引物序列如下：G L U T4上游引物为5′-TT G C A G TG CC T G A G T C TT C TT-3′，下游引物为5′-AT C A C TTT C TG T GGGG C G TT-3′，应用C F X96 R eal-T ime PC R扩增仪，引物浓度为 20μmol/L，常规方法反转录。实时定量PC R体系：5×S Y B R G reen b uf f er10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，25mmol/L d N T P s 0.5μL，2 U/L T a q酶 1.5μL，cD N A模板 5μL，dd H2O32μL。条件：93℃3min，1个循环；93℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，40个循环，于每循环延伸反应最后时刻收集荧光信号。

1.3 统计学方法 采用S P SS 19.0统计学分析软件对数据进行处理，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，治疗前后比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 空白组大鼠精神状态良好，活动灵敏，体表皮毛光滑，食欲及尿量均正常，未出现大鼠死亡；造模组大鼠随着实验的进程逐渐出现皮毛发黄，毛色粗糙、失去光泽，活动减少，喜卧少动，饮水量和尿量均有增加，后期大鼠精神明显变差，出现精神萎靡，反应迟钝，行动迟缓，皮毛粗糙明显，其中2只大鼠死亡，6只大鼠未达标。药物治疗后以上症状均有不同程度的好转和改善。其中解毒化浊组有1只大鼠死亡，模型组3只大鼠死亡。

2.2 造模前后各组大鼠体质量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平的变化情况 造模4周后，与空白组相比，造模组大鼠体质量、F B G、2h P G水平均有升高，ISI显著下降，其差异有统计学意义（P＜0.05），表明造模成功，见表1。

表1 造模前后各组大鼠体质量、FBG、OGTT（2hPG）、ISI水平变化比较

2.3 治疗前后各组大鼠体质量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS水平变化情况 药物治疗10周后，与模型组相比，解毒化浊方与罗格列酮均能降低大鼠F B G、2h P G及F I N S水平，升高ISI，其差异有统计学意义（P＜0.05）；在降低体质量方面与空白组比较解毒化浊组与罗格列酮组差异有统计学意义（P＜0.05）。解毒化浊组与罗格列酮组大鼠血清F B G、2h P G、F I N S比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 治疗前后各组大鼠体质量、FBG、OGTT（2hPG）、FINS、ISI水平变化比较

2.4 各组大鼠骨骼肌中GLUT4表达水平的变化情况 与空白组比较，模型组大鼠G L U T4m R N A的表达水平呈低表达（P＜0.05）；与模型组比较，解毒化浊组与罗格列酮组大鼠G L U T4m R N A的表达水平均较模型组显著增加（P＜0.05）；解毒化浊组与罗格列酮组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠骨骼肌中GLUT4mRNA表达水平变化比较

3 讨论

3.1 解毒化浊方的作用 解毒化浊方是从事临床工作多年，具有丰富治疗经验的康学东教授在孙思邈《千金方》的启发下，依据胰岛素抵抗患者中肥胖者居多组方而来［4］。治则为化浊去痰，清热解毒。解毒化浊方为纯中药制剂，为甘肃中医学院附属医院的院内制剂，方中黄连、黄柏，味苦、性寒，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，两药善清中、下焦湿热，故为君药。现代药理研究证明黄连的主要成分为小檗碱，而小檗碱有降低血清抵抗素，改善胰岛素敏感性的作用[5]；黄柏含有小檗碱，研究显示黄柏提取物(P55A)丁醇提取物能通过激活E R K2及P I3-激酶，促进肝糖原合成，调节血糖浓度[6]；山楂，味酸甘，性微温，无毒，归脾、胃、肝三经，具消食化积、行气散瘀的作用；鸡内金味甘平，入脾、胃、小肠、膀胱经，具有消食健胃、涩精止遗的作用，二药合用可助黄连、黄柏清热、解毒、化浊之功，共为臣药；山楂和鸡内金均有甘油三酯和减少肝及肠系膜中脂肪堆积的作用[7]；枳壳味苦酸、性微寒，具有行气、化痰、消积的功效，可消心下痞塞之痰，泄腹中滞寒之气，推胃中隔宿之食，消腹中连年之积，为佐药[8]；丹参味苦，微寒，具有活血祛瘀的作用，为使药。诸药合用，共奏行气化痰、健脾消积、化湿祛瘀之功。上述药物均可降低血糖，调节血脂，达到肥胖患者的胰岛素抵抗。

3.2 骨骼肌组织GLUT4的表达在T2DM中的作用 G L U T4是葡萄糖转运蛋白家族(G L U Ts)的成员之一，是一种分子量45-55k D，含509个氨基酸单一多肽链的糖蛋白，基本结构由l2个跨膜片断钛链相连[9]。以往认为G L U T4主要存在于骨胳肌、心肌及脂肪组织中。最新研究表明，G L U T4还存在于其他组织细胞中，如初生Balb/c鼠脑组织、马薄片状角化细胞、人和鼠胰岛组织细胞、人子宫内膜细胞和早期人胎盘合体滋养层，并有可能发挥着独特作用。G L U T4的主要功能是在肌肉和脂肪组织中转运葡萄糖。在无刺激时，90%以上的G L U T4分布于细胞内，如微粒体、高尔基复合体、管型囊等囊泡样结构中，这些囊泡样结构称作G L U T4储存囊泡（G S V s）。在胰岛素刺激或运动刺激下，脂肪细胞和骨骼肌细胞中的G L U T4会从细胞内转位至细胞膜上，发挥其转运葡萄糖进入细胞内的生理作用[10]。目前已进一步证实骨骼肌细胞外膜G L U T4的含量与细胞最大葡萄糖转运能力呈正相关，葡萄糖的跨膜转运是骨骼肌细胞利用葡萄糖的主要限速过程。胰岛素刺激的靶组织对葡萄糖的转运在胰岛素抵抗的发病机制中起主导作用。由于G L U T4介导的葡萄糖转运是外周组织葡萄糖利用的限速步骤，因此，有关G L U T4与胰岛素抵抗之间的研究具有重要意义。

本研究依据该信号通路在血糖调节与代谢环节中所起的作用，采用解毒化浊中药干预胰岛素抵抗大鼠，通过检测G L U T4在骨骼肌的表达，从分子水平验证解毒化浊中药改善I R、降糖、提高胰岛素敏感性的作用。

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Effectsof JieDu HuaZhuo Prescription on the ExpressionsofGLUT 4m RNA of the Ratsw ith Insulin Resistance

YANGWeijie,KANG Xuedong△,ZHU Jin,YU Chenzu,WANG Yuanming,AN Xiaoping,ZHANG Hanwen
University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China

Objective:To explore the impactof JieDu HuaZhuo prescription on the expressionsof glucose transporter4(GLUT4)mRNA of the ratsw ith insulin resistance(IR).Methods:Twelve ratswere chosen from 48maleWistar ones,established as the blank group and accepted intragastric adm inistration of physiological saline,the rest rats were fed w ith high lipid fodder to prepare IR ratmodel and random ly divided into themodel group,the treatment group of JieDu HuaZhuo prescription and the treatmentgroup of rosiglitazone,12 rats each group,the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription received the lavageof JieDu HuaZhuo suspension in the concentration of2.025g/（kg·d）and the treatment group of rosiglitazone rosiglitazone suspension in the concentration of 0.36mg/（kg.d），themodel group and blank control group equivalent volumes of physiological saline lavage.To detect the levels of FBG, OGTT(2hPG)and FINS of the rats after treating for ten weeks,andmeasure the levels of GLUT4mRNA in skeletal muscles of the rats by RT-PCR.Results:JieDu HuaZhuo prescription and rosiglitazone could decrease the levels of FBG,2hPG and FINS of the rats,the difference showed statisticalmeaning(P＜0.05),the difference had statistical meaning in reducing body weightw ithin the treatmentgroup of JieDu HuaZhuo prescription(P＜0.05);the difference presented no statisticalmeaning in the levelsof FBG,2hPG and FINSbetween the treatmentgroups(P＞0.05);compared w ith the blank group,the levels of GLUT4 expressions in themodelgroup were low(P＜0.05);compared w ith themodel group,the expressions of GLUT4 in the treatment groups increased significantly(P＜0.05).Conclusion: JieDu HuaZhuo prescription could decrease the levelsof FBG,2hPG and FINSof IR rats,enhanceGLUT4 expressions in the skeletalmuscle and improve insulin sensitivity,therefore,to improve IR.

insulin resistance;JieDu HuaZhuo prescription;glucose transporter4

R587.1

A

1004-6852(2015)07-0008-04

2014-09-02

2012年甘肃省教育厅科研项目计划（编号1206-06）。

杨维杰（1980—），男，硕士学位，主治医师。研究方向：糖尿病及其并发症的中西医结合治疗。

△通讯作者：康学东（1962—），男，主任医师。研究方向：内分泌系统疾病的中西医结合诊治。