大鲵肉对D-半乳糖诱发小鼠衰老相关指标的影响*

蔡佳佳，刘振珂，李吉华，李自发，徐凯勇，徐凌川

山东中医药大学，山东 济南 250355

大鲵肉对D-半乳糖诱发小鼠衰老相关指标的影响*

蔡佳佳，刘振珂，李吉华，李自发，徐凯勇，徐凌川△

山东中医药大学，山东 济南 250355

目的：探讨大鲵肉对D-半乳糖衰老模型小鼠的抗衰老作用和可能的作用机制。方法：将KM小鼠72只随机分为空白对照组、衰老模型组、阳性对照(Vit E)组和大鲵肉低、中、高剂量组，每组12只。除空白对照组外，其他各组均以D-半乳糖诱发亚急性衰老小鼠模型方法造模，腹腔注射D-半乳糖水溶液125 mg／(kg·d)；空白对照组注射同体积注射用水，持续7周；大鲵低、中、高剂量组小鼠分别自由采食16、32、48 mg／(g·d)大鲵肉质，阳性对照组灌胃100 mg／(kg·d)Vit E水溶液，空白对照组灌胃同体积注射用水，持续8周。8周后观察大鲵肉对衰老模型小鼠行为学及基本体征的影响，并检测小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及端粒酶（TE）活性。结果：与空白对照组相比，衰老模型组小鼠体质量增加明显减少，血清SOD和端粒酶活性降低、MDA含量增加(P＜0.01)；与模型组相比，大鲵肉各剂量组小鼠体质量增加升高，血清SOD活性升高，MDA含量减少(P＜0.05)；大鲵肉低、中剂量组小鼠血清端粒酶活性有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；大鲵肉高剂量组及VE组小鼠血清端粒酶活性明显升高(P＜0.05)。结论：大鲵肉对D-半乳糖诱导衰老模型小鼠有抗衰老作用，其机制可能与提高小鼠血清SOD、端粒酶活性，减少MDA含量有关。

衰老模型；小鼠；大鲵；D-半乳糖；体质量；超氧化物歧化酶；丙二醛；端粒酶

中国大鲵（Andrias davidianus）简称大鲵，俗名娃娃鱼、人鱼、孩儿鱼，两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属，是中国特有的珍稀大型两栖动物[1]，被誉为“水中人参”[2]。中医认为，大鲵性甘淡，能截疟，具有滋阴补肾、补血行气的功效[3]。

以往的研究多集中于养殖、形态、分布等方面，对大鲵药理学的研究报道较少。本研究针对衰老的氧化损伤学说和端粒学说，采用D-半乳糖亚急性衰老小鼠模型[4]，以维生素E(V it E)[5]作为阳性对照，观察大鲵肉对小鼠基本体征及行为学的影响，研究其抗衰老作用；并观察其对小鼠血清超氧化物歧化酶(S OD)和端粒酶活性以及对丙二醛(MDA)含量的影响，初步探讨大鲵肉抗氧化、抗衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 受试动物为S P F级KM小鼠，体质量25～28 g，雌雄各半，由山东中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：S C X K(鲁) 20110003，使用许可证号：S YX K(鲁)20110019。

1.2 药品与试剂 大鲵由浙江舟山惠和堂生物科技有限公司提供，经山东中医药大学徐凌川教授鉴定。D-半乳糖(南京生兴生物技术有限公司提供，生产批号7H307H C O)；维生素E粉末（购于嘉兴天和诚生物科技有限公司，生产批号20130308004）；端粒酶检测试剂盒(生产批号201304)、S OD检测试剂盒(型号：A001-1，生产批号20130510)、MDA检测试剂盒 (型号：A003-1，生产批号20130509)均购于南京建成生物工程研究所，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器 C O2培养箱（Shanghai Lishen S c ienti f i c E q u i p ment C O.，L td）；52A型医用低速离心机（安新县白洋离心机厂）；电热恒温水浴锅（北京医疗设备厂有限公司）；洗板机（ELX50，BI O-T E K In s t r u ment.I N C）；酶标仪（ELX808IUU it ra M i cro p late R ead）；电子分析天平(BS2105，北京赛多利斯天平有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与处理 将KM小鼠72只随机分为空白对照组、衰老模型组、阳性对照(V it E)组和大鲵肉低、中、高剂量组，每组12只。除空白对照组外，其他各组均按文献记载采用D-半乳糖诱发亚急性衰老小鼠模型方法[3]造模，腹腔注射D-半乳糖水溶液125m g／(k g·d)，空白对照组注射同体积注射用水，持续7周；大鲵低、中、高剂量组小鼠分别自由采食16、32、48m g／(g·d)大鲵肉质；阳性对照组灌胃100m g／(k g·d)V it E水溶液；空白对照组灌胃同体积的注射用水，持续8周。8周后，摘眼球取血处死小鼠，分离血清，取上清液待测。

1.4.2 小鼠一般行为学观察及体征记录 实验期间每天观察小鼠一般行为改变，包括进食、活动、毛色改变等情况，每5天称小鼠体质量，观察各组小鼠体质量变化情况。

1.4.3 SOD、TE活性测定和MDA含量测定 实验动物摘眼球取血（不少于0.5 m L），血液室温自然凝固（20～30 min），3 000 r/min离心15 min，分离血清置-20℃冻存。取血清分别测定MDA含量(硫代巴比妥酸T B A法)、S OD活性(黄嘌呤氧化酶法)和T E活性（酶联免疫分析EL IS A法），操作步骤按试剂盒说明书进行，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度(A)值。

1.5 统计学方法 数据采用S P SS 17.0软件进行统计分析。2组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，多组间均数两两比较采用S N K-q检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 行为学指标观察结果 造模前各组动物反应良好，毛发光滑，饮食正常，行动敏捷。与空白对照组相比，造模后2周起衰老模型组小鼠相继出现不同程度进食减少、倦怠少动、反应迟缓、嗜睡、毛发干枯稀疏发黄缺乏光泽现象。大鲵肉各剂量组和VE组上述改变均不同程度得到缓解。

2.2 小鼠体质量变化结果 体质量变化差异在造模后3周出现并逐渐扩大，各组小鼠8周后体质量变化差异显著，实验期间衰老模型组小鼠体质量增加较正常组明显降低，大鲵肉各剂量组和V it E组体质量增加均大于衰老模型组（P＜0.01），见表1。

表1 大鲵肉对D-半乳糖诱导衰老小鼠体质量的影响（±s）

表1 大鲵肉对D-半乳糖诱导衰老小鼠体质量的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△表示P＜0.01；与衰老模型组比较，*表示P＜0.01；与VE组比较，#表示P＜0.05。

6.8±1.13 1.6±1.26△4.8±1.13*2.6±1.96*4.6±2.05*6.5±1.35*#组别 剂量（mg/kg） 实验前/g 实验3周后体质量/g 实验8周后体质量/g空白对照组衰老模型组Vit E组大鲵肉低剂量组大鲵肉中剂量组大鲵肉高剂量组--100 0.016 0.032 0.048 26.8±0.48 27.7±0.12 26.4±0.22 27.7±0.28 26.5±1.01 27.1±0.13 32.8±0.24 29.3±1.17 31.2±1.92 29.3±2.63 31.1±2.12 33.6±0.44

2.3 小鼠血清SOD、MDA及端粒酶活性的检测结果 与空白对照组比较，模型组小鼠各项指标变化显著，血清中S OD活性降低、MDA含量增加（P＜0.01）；与衰老模型组相比，大鲵肉各剂量组和V it E组小鼠S OD活性均有明显提高、MDA含量均有不同程度下降，且符合量效关系；其中大鲵肉高剂量组数据相较其他实验组在S OD活性、MDA含量方面变化更为显著（P＜0.05）。

对小鼠血清端粒酶活性的影响方面，大鲵肉低、中剂量组小鼠血清端粒酶活性有升高趋势，但无统计学意义；大鲵肉高剂量组及V it E组小鼠血清端粒酶活性明显升高（P＜0.05），作用具有一致性，见表2。

表2 大鲵肉对D-半乳糖诱导衰老小鼠SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影响（±s）

表2 大鲵肉对D-半乳糖诱导衰老小鼠SOD活性、端粒酶活性及MDA含量的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△表示P＜0.01；与衰老模型组比较，**表示P＜0.01,*表示P＜0.05；与VitE组比较，#表示P＜0.05。

3 讨论

祖国医学认为动物药属“血肉有情之品”，许多动物药疗效确实,历史悠久,然而对其有关化学研究方面的记载较少。大鲵是中国特有的一种珍稀大型两栖动物,是传统名贵药用动物，也是一种食用价值极高的经济动物[6]。陶弘景首次将大鲵列为药用动物，明代《本草纲目》将大鲵归为鳞部，无鳞鱼类，记载其有滋阴补肾，补血行气之功效。食用鲵肉可强壮体质，有效防治贫血、月经失调等症，对防止心血管疾病、贫血和肿瘤有一定的作用[1]。但近年应用整体衰老动物模型研究大鲵肉抗衰老作用少见报道。

衰老是生物体在生命周期中随着年龄增长而发生的全身各组织器官功能衰退和稳态功能下降的过程,是机体各种生化反应的综合表现[7]。在衰老与抗衰老研究中，D-半乳糖诱导亚急性衰老模型以其自身的诸多优势如实验周期短、个体差异小、重现性稳定、方法可靠[4]，成为国内常用的衰老相关研究的动物模型。

依据自由基学说，衰老与自由基引起的生物膜脂质过氧化密切相关[7-9]。S OD是机体防御体系中能够清除体内氧化物自由基的关键酶，反映机体清除自由基、保护细胞免受自由基损伤的能力。MDA是机体在氧自由基作用下生成的脂质过氧化物，其水平可反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。因此，本研究初步确立以S OD活性、MDA含量的指标变化进行大鲵肉抗氧化的研究。

本研究显示，衰老模型组在连续注射D-半乳糖7周后，小鼠体质量增加缓慢、活动能力降低，体内S OD活性降低、MDA含量升高。采食大鲵肉能够明显改善以上情况，增加D-半乳糖致衰老小鼠的体质量，同时，血清检测发现，大鲵肉治疗组小鼠S OD活性明显增强，MDA含量明显降低，提示其可能通过直接清除体内氧自由基和激活抗氧化防御系统等作用提高机体的抗氧化能力，减少自由基对机体的损伤，从而起到延缓衰老的作用。同时，高剂量组的作用最为明显,说明其促进机体抗自由基损伤的作用可随剂量增加而增强。

端粒及端粒酶很可能是抗衰老药物作用的靶点[10]，研究表明，V it E作为自由基清除剂，其抗衰老作用与端粒酶作用于细胞生长、发育和凋亡等过程密切相关[11]。本研究显示，大鲵肉高剂量对D-半乳糖衰老模型小鼠血清端粒酶活性的作用效果与V it E有一致性，对小鼠端粒酶活性有明显提高作用，提示激活部分组织细胞的端粒酶活性，延缓端粒缩短可能是其抗衰老作用的机制之一。

[1] 费梁,胡淑琴.中国动物志·两栖纲：上卷[M].北京:科学出版社,2006:244-249.

[2] 张神虎.大鲵药用价值及人工养殖[J].广西农业生物科学, 2001,20(4):309-310.

[3]《中国药用动物志》协作组.中国药用动物志[M].天津：天津科学技术出版社,1979:163-166.

[4] 徐智,吴国明,钱桂生,等.大鼠衰老模型的初步建立[J].第三军医大学学报，2003,25(4):312-315．

[5] 周筱丹,董晓芳,佟建明.维生素E的生物学功能和安全性评价研究进展[J].动物营养学报,2010,22(4):817-822.

[6] 高士贤,戴定远,范勤德.常见药用动物[M].上海:上海科技出版社,1994：140-141.

[7] Hindra JS.老年生物学与医学[M].肖德桢，译.北京:科学出版社,1980:112.

[8] 胡维新.医学分子生物学[M].北京：科学出版社，2010：1741-1745.

[9] 朱赓伯.促进人体衰老的凶恶敌人——自由基[J].生命的化学,1993,3(1):16.

[10]de Lange Titia.Protection of mammal ian telomeres [J].Oncogene,2002,21(4):532-540.

[11]胡梦瑶,隋宜伦,谢飞舟,等.端粒-端粒酶系统与氧化还原微环境[J].生物物理学报,2012,28(5):411-421.

EffectsofGiantSalam anderM eaton Physiological IndexesofD-galactose Induced Aging M iceModels

CAIJiajia,LIU Zhenke,LIJihua,LIZifa,XU Kaiyong,XU Lingchuan△
Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China

Objective:To explore anti-aging effectsof giantsalamander（Andrias davidianus）meaton D-galactose induced agingmicemodels and its potentialmechanism.Methods:A ll 72 KM m icewere randomized into blank controlgroup,agingmodelgroup,positive control(Vit E)group,low,moderate and high doses groups of giantsalamandermeat,12m ice each group.Exceptblank control group,micemodelswere prepared by peritoneal injection of D-galactoseaqueoussolution in the concentrationsof125mg/(kg·d);blank controlgroup were givenwater for injections in the same volume for seven consecutiveweeks;them ice in low,moderate and high doses groups of giantsalamandermeatategiantsalamandermeat respectively and freely in the concentrationsof16，32 and 48mg/(g·d),positive controlgroup received intragastric administration of VitE aqueous solution in the concentrationsof100mg/(kg· d),and blank controlgroupwater for injections in the same volume foreightconsecutiveweeks.The influence ofgiant salamandermeaton ethology and basic featuresof agingmicemodelswereobserved in eightweeks,theactivity of superoxide dismutase(SOD),the contents ofmalondialdehyde(MDA)and the activity of telomerase(TE)in the serum of them icewere detected.Results:Compared w ith blank control group,body weightof themice in the agingmodel group decreased notably,the activity of SOD and TE lowered,the contents of MDA increased(P＜0.01)；compared w ith themodelgroup,body weightof them ice in different doses groups of giant salamandermeat increased remarkably,the activity of SOD increased and the contentsofMDA decreased(P＜0.05)；the activity of TE in them ice of low andmoderate groups showed the tendency of rising,while the difference had no statisticalmeaning(P＞0.05)；the activity of TE in them ice of high doses group of giant salamandermeatand Vit E group rose obviously(P＜0.05).Conclusion:Giant salamandermeat show anti-aging effect on D-galactose induced aging mice models,itsmechanism m ightbe related to increasing the activity of SOD and TE in the serum of them ice and reducing the contentsofMDA.

agingmodel;m ice;giantsalamander;D-galactose;bodyweight;SOD;MDA;telomerase

R285.5

A

1004-6852(2015)07-0004-04

2014-09-02

国家级大学生创新创业训练计划项目（编号200310441022）。

蔡佳佳（1992—），女，学生。研究方向：中西医临床与中医复方现代化。

△通讯作者：徐凌川（1962—），男，教授。研究方向：中药资源开发与质量评价。