通窍开玄法对鼻窦炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白相关基因影响研究*

敬 樱，张天娥△，罗再琼，赵 静，张勤修，杨九一

1成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137；2成都中医药大学附属医院

通窍开玄法对鼻窦炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白相关基因影响研究*

敬 樱1，张天娥1△，罗再琼1，赵 静1，张勤修2，杨九一1

1成都中医药大学基础医学院，四川 成都 611137；2成都中医药大学附属医院

目的：应用基因芯片技术分析通窍开玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜水通道蛋白（AQP）的影响，并探讨其治疗鼻窦炎的生物学机制。方法：实验大鼠随机分为实验组、模型组和正常组，每组10只，实验组和模型组据Y.Gel的改良方法造模，正常组不做任何处理。造模成功后实验组分别给予三和通窍开玄汤低剂量组、三和通窍开玄汤中剂量组、三和通窍开玄汤高剂量组、青霉素V钾片灌胃7天，处死动物取鼻黏膜组织，应用Agilent基因芯片检测各组大鼠鼻黏膜水通道蛋白基因表达，并进行显著性分析。结果：中药各组均上调AQP1表达，中剂量组、高剂量组又上调AQP2，青霉素V钾组上调AQP12b基因；4组均下调AQP9基因，中药低剂量组还可下调AQP2、AQP12b，青霉素V钾组还可下调AQP1、AQP2。结论：三和通窍开玄汤与青霉素V钾片均对鼻窦炎具良好治疗效果，但调控的AQP相关基因表达机制不同，且中药组作用更为广泛，表明对AQP相关基因的调控可能是通窍开玄法治疗鼻窦炎生物学机制之一，AQP是玄府重要实质之一。

鼻窦炎；基因芯片；通窍开玄法；水通道蛋白

水通道蛋白(a q u a p or i n，A Q P)是一组细胞膜上选择性高效转运水分子的特异孔道，它在体内各系统组织中广泛表达，除了在与体液分泌和呼吸密切相关的多种上皮和内皮细胞高表达外，在一些与体液转运无明显关系的组织细胞等处也有表达，它可能在多种器官生理和病理中发挥重要作用[1]。玄府是广泛存在于机体五官九窍、脏腑内外的微观孔窍，具有流通气液、渗灌气血等作用，是迄今为止中医学有关人体结构层次中最为细小的单位，与A Q P有较多的共性[2]。本课题组前期研究显示运用通窍开玄法治疗鼻窦炎模型大鼠效果显著，认为可能与通窍开玄法调控A Q P有关。因此，本研究应用基因芯片技术，从基因表达水平探讨开窍通玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜水通道蛋白影响，揭示通窍开玄法治疗鼻窦炎的生物学机制，为通窍开玄法提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 S D大鼠60只，雌雄各半，体质量200～250 g，由成都中医药大学动物实验中心提供。

1.2 实验药品 实验用药三和通窍开玄汤（白芷10 g，细辛3 g，辛夷10 g，鹅不食草12 g，黄芩10 g），由成都中医药大学附属医院制剂室，按照国家标准制剂工艺制成研究用药液。药液浓度为每毫升含生药2 g（2 g/mL）。青霉素V钾片：市售，5～18.7m g/（kg·d-1）。

1.3 实验试剂 T R I Z OL试剂 (货号：15596-018，L i f e tec h n o l o g i es，Car l sbad，CA，U S）、R N A迷你提取试剂盒 (货号：74106，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)、R N ase-f ree D N ase set试剂 (货号：79254，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)、Low I n p u t Q ui c k Am p Labe l i ng K i t（货号：5190-2305，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S），O n e-Co l or、R N A S p i k e-I n K i t（货号：5190-2305，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、O n e-Co l or、Ge n e E x p ress i o n K i t（货号：5188-5242，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、Ge n e E xp ress i o n W as h B u f f er K i t（货号：5188-5327，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）。

1.4 实验仪器 安捷伦生物分析仪2100(A g il e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S)、杂交炉（型号：G2545A，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）、sta i n i ng d i s h es(型号：121，T h ermo S h a n do n，W a l t h am，M A，U S)、安捷伦芯片扫描仪（型号：G2565CA，A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S）。

1.5 实验方法

1.5.1 动物造模分组 实验S D大鼠60只，适应性饲养1周后，参考相关文献[3]的方法：随机取60只大鼠，按0.5m g/kg腹腔注射氯胺酮全身麻醉，同时用利多卡因1.52～2.0mL(20m g/mL)配肾上腺素0.0125m g，鼻背下浸润麻醉，在面中线上中1/3交界处旁3mm以45度角作切口，塞入带有金葡萄球菌的明胶海绵于内，缝合切口，建立急性鼻窦炎大鼠模型。造模第7天后，随机抽取正常大鼠5只及模型大鼠5只处死，进行模型评价。其余模型大鼠随机分为中药高剂量组、中药中剂量组、药低剂量组、青霉素V钾组、模型对照组，前余10只大鼠为正常空白对照组。每组10只，共60只。

1.5.2 给药 从造模成功后的第1天开始灌胃连续7天，每日各组均早晚两次灌服。中药高剂量组，每日以相当于临床成人剂量20倍的药物灌胃（50mL·kg-1·d-1)；中药中剂量组，每日以相当于临床成人剂量10倍的药物灌胃（25mL·kg-1·d-1)；中药低剂量组，每日以相当于临床成人剂量5倍灌胃（15mL·kg-1·d-1)；青霉素V钾片组，每日以相当于临床成人剂量5倍的青霉素V钾片制成混悬液灌胃(含药量10m g·kg-1·d-1)。模型对照组：造模后，每日以等量生理盐水灌胃。正常空白对照组：不灌胃，常规喂养。

1.5.3 标本的采集与处理 于灌胃结束后次日处死大鼠，在超净台冰盘上摘取鼻黏膜组织，无R n ase P B S缓冲液冲洗两次，放入冻存管，置液氮罐保存，备提取 R N A。根据试剂盒说明书R N easy m i n i k i t(Cat#74106，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)和R N ase-Free D N ase S et(Cat#79254，Q IAG E N，Gm B H，Germa n y)提供的标准操作流程进行样品的总R N A抽提，并纯化总R N A，经安捷伦2100芯片生物分(A g i l e n t tec h n o l o g i es，S a n ta C l ara，CA，U S)电泳质检。

1.5.4 基因芯片检测 质检合格的R N A进行单荧光标记，利用A g i l e n t大鼠全基因4×44K芯片检测，依次进行芯片杂交、洗涤，采用安捷伦芯片扫描仪进行扫描获取荧光信号。用Feat u re E xt ract i o n so f tware 10.7(A g i l e n t tec h n o l og i es，S a n ta C l ara，CA，U S)采转换荧光信号为数值，最后采用Ge n e S p r i ng S o f tware 11.0进行归一化处理，所用的算法为Q u a n t i l e，获取各组基因表达值。

1.5.5 各组差异基因情况分析 用E x ce l计算实验组与模型对照组基因表达rat i o值，通常设定差异倍数的阈值为小于0.5或大于2为基因差异评判标准，大于2表示基因上调2倍，小于0.5表示基因下调2倍。分析显示，实验组与模型对照组相比：中药低剂量组得到4 632条差异基因，中药中剂量组得到5 397条差异基因，中药高剂量组得要5 348条差异基因，青霉素V钾组得到352条差异基因。

2 结果

2.1 聚类分析 利用斯坦福大学C l u st r和T ree v i ew软件，过滤数据，以At l east 1 observ at i o n s w i t h abs=4.0，M a x Va l-M i n Va l≥2.0可以清楚看到c D N A微阵列中5 572个基因在空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、青霉素V钾片组比较后的基因表达情况，其中每个小格代表一个基因，黑色表示无差异，红色表示上调，绿色表示下调，颜色的变化程度与基因表达的差异性成正比。从图1中可以看出中药各剂量组、青霉素V钾组均和空白组聚类，说明药物治疗有效。

图1 实验组与对照组聚类分析图

2.2 基因芯片的生物信息学分析 利用K E GG数据库分析差异表达基因生物学通路，中药低剂量组差异基因涉及278条通路改变、中药中剂量组差异基因涉及276条通路改变、中药高剂量组差异基因涉及277条通路改变，青霉素V钾片组差异基因涉及193条通路改变，各组均涉及了包括炎症发生、抗原提呈、补体激活等免疫学通路等，体现了各组实验动物存在炎症的本质。

用药组与模型组比较，在所有差异基因中，筛选出了水通道蛋白差异基因。目前A Q P已在哺乳动物体内发现了13种(A Q P0-A Q P12)[4]，课题组通过筛选仅发现A Q P1、A Q P2、A Q P9、A Q P12b四种水通道蛋白基因出现在本次动物实验中。四种水通道蛋白基因表达情况如图2所示，可见中药组对水通道蛋白基因有明显调控作用。中药各剂量组和青霉素V钾组与模型组比对这四种A Q P基因的调控如图3—4所示，可见中药低剂量组主要上调了A Q P1水通道蛋白基因，中剂量组与高剂量组主要上调了A Q P1、A Q P2水通道蛋白基因，而青霉素V钾组主要上调了A Q P12bA Q P基因；中药低剂量组主要下调了A Q P9、A Q P2、A Q P12bA Q P基因，中剂量组与高剂量组则主要下调了A Q P9、A Q P12b水通道蛋白基因，而青霉素V钾组主要下调了A Q P1、A Q P2、A Q P9水通道蛋白基因，4组均下调了A Q P9水通道蛋白基因。

图2 实验组与对照组聚类分析图1

图3 实验组与对照组聚类分析图2

图4 实验组与对照组聚类分析图3

3 讨论

课题组前期提出了鼻腔玄府学说与“双窍闭塞、双毒互结”的鼻窦炎发病新观点[4-5]，认为玄府广泛存在于鼻腔鼻窦的黏膜，其有序的开阖维持着气液在鼻腔鼻窦黏膜的循环交通，保证了鼻腔鼻窦黏膜的正常形态及生理功能[6]。而外邪入侵、邪毒内生郁阻鼻中窦窍与玄府，导致双窍闭塞是鼻窦炎发病的重要机制，因此在治疗上应以“通鼻窍、开玄府”为治则，形成“三和通窍开玄汤”加减治疗。方中白芷燥湿升阳，细辛、辛夷芳香祛湿，鹅不食草散风利肺，黄芩燥湿解毒，诸药共用，通窍开玄，治疗Ⅰ型、Ⅱ型1期的鼻窦炎患者225例，总体疗效达85%以上[5]。本研究运用基因芯片技术探讨通窍开玄法对鼻窦炎模型大鼠鼻黏膜A Q P影响。研究表明三和通窍开玄汤不同剂量组和青霉素V钾组均可治疗鼻窦炎模型大鼠，其生物学机制可能与良性调控水通道蛋白有关。

我们认为A Q P可能是玄府重要实质之一，两者都具有普遍存在性、结构微观性，功能上均可流通水液[2]。本次实验也发现三和通窍开玄汤不同剂量组可分别调控A Q P1、A Q P2、A Q P9、A Q P12b四种水通道蛋白基因表达，且表达明显。研究发现：A Q P l在消化道黏膜下层和固有层的小血管、小肠中央乳糜管内皮以及涎腺、唇腺腺泡的基膜有分部[7]、血管新生过程中[8]、鼻黏膜组织、肌肉组织、结缔组织、神经组织、肿瘤组织等多种组织中表达[9]；A Q P2分布于肾及与内淋巴代谢有关的结构中[4]；A Q P9在子痫前期胎盘[10]、合体细胞滋养细胞的顶质膜、羊膜上皮细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、肝细胞膜、生精小管内表面等部位都有分布[11]；A Q P l2仅分布于胰腺的腺泡细胞上和细胞内的细胞器上[4]。既往文献报道中除了A Q P1在鼻黏膜中有分布，其余三个A Q P基因均未被报道可分布于大鼠鼻黏膜中。而本次实验则见A Q P2、A Q P9、A Q P12b分布于大鼠鼻黏膜，尚属首次报道，进一步证实了水通道蛋白可能是玄府重要实质之一。

综上所述，鼻中玄府闭郁是鼻窦炎发病的基本病机，通窍开玄法是治疗鼻窦炎的有效方法，其发挥疗效的生物学机制可能与调控水通道蛋白有关。实验结果也表明，三和通窍开玄汤与青霉素V钾均可治疗鼻窦炎大鼠，但中药组作用更为广泛，其治疗机制不同，尚需进一步研究。

[1] 冯学超，麻彤辉.水通道蛋白的生理功能——水通道基因敲除小鼠表型研究进展[J].生物化学与生物物理进展2005，32（4）：291.

[2] 张天娥，罗再琼，张勤修,等.玄府与水通道蛋白的比较[J].辽宁中医杂志，2009，36（7）：1110.

[3] 朱天民，熊大经，袁晓辉,等.鼻渊舒口服液对急性鼻窦炎大鼠基因表达谱影响的实验研究[J].浙江中医杂志，2007，42（5）：297.

[4] 刘树荣，张少斌.水通道蛋白结构与功能研究进展[J].现代预防医学，2007，34(12)：2260-2262.

[5] 张勤修，熊大经.鼻玄府学说理论探微[J].中华中医药杂志，2010，25（3）：334-335.

[6] 何群明，蒋友琼，张勤修，等.试从玄府论鼻渊［J］．四川中医，2008，26(10)：31-32.

[7] Matsuzaki T，Tajika Y，Abl imit A，et a1.Aquaperim in the digestive system[J].Med Elect ron Micresc，2004，37(2)：71-74．

[8] Keneko K，Yngui K，Tanaka A，et a1．Aquaporin 1 isrequired for hypoxia-inducible angiogenesis inhuman retinal vascular endothelial cel ls．MierovnscRes，2008，75(3)：297-299.

[9] 谭美芸.水通道AQP1的研究进展[J］.中国实用医药，2010，5（9）：241-244.

[10]Aharon R.Bar Shavit Z.Involvement of aquaporin 9 in osteoclast di f ferentiation[J］.J Biol Chem，2006，281（28）：19305-19321．

[11]王燕燕，张秀果.水通道蛋白9的研究进展[J］.国际医药卫生导报，2009，15（22）：122-124.

Research on the Influenceof TongQiao KaiXuan Method on AQP-related GeneofNasal Mucosa in Ratsw ith Nasosinusitis

JING Ying1,ZHANG Tian'e△1,LUO Zaiqiong1,ZHAO Jing1,ZHANG Qinxiu2,YANG Jiuyi1
1 Basic Medical School of Chengdu University of TCM,Chengdu 611137,China; 2 Teaching Hospital of Chengdu University of TCM

nasosinusitis;gene chip;TongQiao KaiXuan method;aquaporin

R285-5

A

1004-6852(2015)08-0008-04

2014-10-25

国家自然科学基金项目(编号：81072727)；四川省教育厅重点资助项目(编号：09ZA022)。

敬樱(1989—)，女，硕士学位。研究方向：中医治则治法。

△通讯作者：张天娥(1970—)，女，硕士研究生导师，研究员。研究方向：证候的生物学基础。

Abst ract Objective:To analyze theeffectsof TongQiao KaiXuan method on aquaporin(AQP)of nasalmucosa in ratmodelw ith nasosinusitis by gene chip technology,and discuss its biologicalmechanism of treating nasosinusitis.Methods:The ratswere random ized into the experimentgroup,themodelgroup and the normalgroup,the rats in the experimentgroup and themodel group were prepared by Y.Gel reformingmethod,the normalgroup were unhandled.A fter successfully establishing themodels,the experimentgroup accepted intragastric adm inistration of San-He TongQiao KaiXuan Tang in high,moderateand low dose,and phenoxymethylpenicillin potassium tablets for seven consecutive days,nasalmucosawas obtained from the animals,the AQPexpressions of the rats in all the groupswere detected with Agilentgene chip,and analyzed significantly.Results:AQP1 expressions raised in the groups of TCM, AQP2 expressions raised inmoderate and high doses groups,AQP12b genewas up-regulated in phenoxymethylpenicillin potassium tablets group;AQP9 gene was down-regulated in four groups,AQP2 and AQP12b decreased in low dose groups of TCM,AQP1 and AQP2 were down-regulated in phenoxymethylpenicillin potassium tablets group. Conclusion:SanHe TongQiao KaiXuan Tang and phenoxymethylpenicillin potassium tablets show better clinical effects in treating nasosinusitis,but themechanisms of regulating AQP-related gene expression are different,and the functionsof TCM groupsare extensive,which demonstrates the regulation of AQP-related genesmightbe one of biologicalmechanismsof TongQiao KaiXuan method in treating nasosinusitis,AQP isone of the importantsubstancesof the sweatpores.