“肤敏”膏对大鼠PCA模型T淋巴细胞及其亚群的影响

李静平，李庆生，祁 燕

1云南中医学院，云南 昆明 650500；2昆明医科大学；3云南省中医院

“肤敏”膏对大鼠PCA模型T淋巴细胞及其亚群的影响

李静平1，李庆生2，祁 燕3

1云南中医学院，云南 昆明 650500；2昆明医科大学；3云南省中医院

目的:研究“肤敏”膏对大鼠被动皮肤过敏反应（PCA）模型T淋巴细胞及其亚群的影响，探讨其抗皮肤过敏作用机理。方法:用卵白蛋白建立大鼠PCA模型，采用免疫荧光流式细胞技术检测PCA大鼠外周血CD3＋T、CD4＋T和CD8＋T细胞表达率及“肤敏”膏对3种细胞的影响作用。结果:与模型组比较，“肤敏”膏3剂量组CD3＋T和CD4＋T细胞表达率均值较模型组明显升高（P＜0.05）。结论:“肤敏”膏的作用机理可能与其调节CD3＋T、CD4＋T的数量紊乱有关，从而间接的干预Th1/Th2细胞分化及平衡,在过敏反应早期调节细胞免疫平衡以阻断病变进程。

大鼠PCA模型；T淋巴细胞及亚群；“肤敏”膏

“肤敏”膏是云南省名中医李庆生教授在长期临床实践和科研工作中总结、结合文献筛选确定的治疗过敏性皮肤病的有效中成药制剂。笔者在完成新药临床前各项系统研究并获肯定药效学资料的基础上,开展“肤敏”膏的治疗作用机理及关键作用靶点探索，为该中药复方制剂的深层次研发奠定工作基础。

C D3+T细胞分子可表达所有成熟T细胞，即代表所有成熟T细胞。而在成熟T细胞表面可分为C D4+T和C D8+T细胞两个亚类。C D4+T细胞介导的细胞免疫可引起一系列皮肤炎症发生，而C D4+T细胞进一步分为T h1和T h2两细胞亚群，后者合成和分泌大量细胞因子进而吸引炎症细胞趋向局部。故T h1/T h2细胞平衡失调是诱发过敏性皮肤病的重要因素。而C D4+T细胞为T h1/T h2细胞分化的前体细胞，C D4+T/C D8+T细胞平衡直接影响后续T h1/T h2细胞平衡。药物能否干预调节T淋巴细胞（C D3+T细胞）及其亚群细胞（C D4+T/C D8+T细胞）的数量、功能及比例，使这种失衡重新回到平衡,无疑是从根本上有效治疗本病的关键新举措。因此，本实验通过建立大鼠P CA模型，观察不同剂量“肤敏”膏对T h1、T h2细胞分化的前体细胞C D3+T、C D4+T细胞的影响，进而反映“肤敏膏”对皮肤过敏细胞免疫功能紊乱的影响，揭示该中成药作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 S P F级S D大鼠，体质量200～300g，雌雄兼用，由四川医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：S C X K(川)2012-16。

1.1.2 试剂 卵白蛋白（E gg A l b u m i n）：Si g ma进口分装，由天津市灏洋生物制品有限责任公司分装，批号 A-5378。FI T C a n t i-rat C D3，P E a nt i-rat C D4，P E a n t i-rat C D8，R B C裂解液，P B S洗涤液均为美国B i o l e g e n d公司原装进口。地塞米松：昆明振华制药厂生产，0.75m g/片，批号120417。

1.1.3 仪器 FAC S Va n ta g e S E型流式细胞仪（美国BD公司生产），S P X-250BZ电子恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产），T GL-20M高速台式离心机（上海第三仪器厂生产）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PCA（被动皮肤过敏反应）模型的建立[1]大鼠抗血清制备：雄性大鼠，180～220 g，每侧大腿肌肉注射1%卵白蛋白0.5mL，同时腹腔注射5%氢氧化铝凝胶0.1mL。14天后取血，2000 r p m离心10分钟，制备大鼠抗卵白蛋白血清，置低温冰箱保存。注：氢氧化铝凝胶制备：称取适量氯化铝，加少量生理盐水溶解，用氢氧化钠溶液调p H至8即可。大鼠同种P CA：除正常组外，其余各组大鼠背部皮内注射1∶2稀释的抗血清，0.1mL/点，共2点，24小时后，按10mL/kg的给药容积静脉注射2%卵白蛋白溶液攻击。

1.2.2 实验分组 大鼠60只，雌雄各半，随机分成6组，每组10只，分别为低、中、高剂量“肤敏”膏组，阳性组（地塞米松）、模型组和正常组。灌胃给药剂量依次为1.04，2.07，7.24，0.00041g/kg,模型组和正常组均给予同体积生理盐水。灌胃1次/d，连续5天。除正常组外，各组大鼠于第5天分别背部皮内注射稀释的抗血清致敏，24小时后静脉注射2%卵白蛋白溶液进行攻击，30分钟后大鼠用3.5%的水合氯醛麻醉，腹主动脉取血 2~3mL，肝素钠充分抗凝，检测T淋巴细胞及其亚群。

1.2.3 T淋巴细胞（CD3+T细胞）及其亚群（CD4+T、CD8+T细胞）测定[2]采用免疫荧光流式细胞技术检测T淋巴细胞及其亚群。1）每只动物分别取2份各100μL的抗凝全血置于2个流式管中，每管中分别加入FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D4和FI T C a n t i-rat C D3、P E a n t i-rat C D8，进行荧光标记。2）将上述各管避光、2~8℃孵育30分钟。3）取出各管分别加入R B C裂解液2 mL，使红细胞充分裂解至管内液体澄清透亮为止。离心（100 r/m i n），弃上清液。4)各管分别用1.5 mL P B S液洗涤2~3次，离心，弃上清液。5）各管加入200~ 300μL P B S液，充分弹开细胞，上机检测。6）流式细胞仪检测条件及参数采用美国BD公司生产的FAC S Va n ta g e S E型流式细胞仪，激发光源为15m W氩离子激光器，激发波长为 488 n m，应用C E LL Q u est进行免疫荧光数据分析。检测前以f l ow-c h ec k F l u or p h eres(10u m)荧光微球（R E F 6605359 B ec k e n Co u l ter，I n c f u l l erto n，CA 92835）作为标本样品，调整仪器CV值在2%以内。1.3 统计学方法 用S P SS 19.0软件进行统计分析，计量资料以(±s)表示，符合正态分布组间采用A N OVA分析，方差齐者组间进行L S D-t检验，方差不齐者进行T am h a n e’s T2检验，不符合正态分布的组间采用非参数检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

与正常组比较，造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T细胞表达率均值明显降低，差异具有显著性意义（P＜0.01）；而C D8+T细胞无统计学意义（P＞0.05）。经给药后，与模型组比较，“肤敏膏”低、中、高3剂量组C D3+T和C D4+T细胞表达率均值明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C D8+T细胞无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 对大鼠T淋巴细胞及其亚群的影响%

3 讨论

C D3+T细胞可代表所有成熟T细胞。而在成熟T细胞表面可分为C D4+T和C D8+T细胞两个亚类。即辅助性T细胞（T h）和抑制性T细胞（T s）。C D4+T细胞介导的细胞免疫可引起组织以淋巴细胞（主要是T细胞）和单核吞噬细胞浸润为主的渗出性炎症发生。致敏后各种炎症细胞和活性因子引起血管扩张、管壁通透性增强，形成湿疹样病变，表现为红斑、丘疹、水疱等一系列皮肤炎症反应。同时C D4+T细胞进一步分为T h1和T h2两细胞亚群，它们合成和分泌大量细胞因子如IL-2、4、6、10，IF N-γ、T N F-β、L T等，进而吸引炎症细胞趋向局部。所以C D4+T细胞为T h1/T h2细胞分化的前体细胞，C D4+T/C D8+T细胞平衡直接影响后续T h1/T h2细胞平衡[3-4]。故进行C D3+T、C D4+T、C D8+T细胞含量测定以反映“肤敏膏”对皮肤过敏细胞免疫功能紊乱和T h1/T h2细胞分化的前体细胞的影响。

实验结果表明：造模后大鼠外周血C D3+T和C D4+T细胞表达率均值明显降低，（P＜0.01）。C D8+T细胞有升高趋势，但无统计学意义（P＞0.05），C D4+T/C D8+T比值与正常对照组相比明显降低（P＜0.05），这与邓丹琪[3]的研究结果一致，反映出模型动物存在细胞免疫功能紊乱。经“肤敏膏”低、中、高3剂量组治疗后，大鼠C D3+T和C D4+T细胞表达率均值不同程度升高（P＜0.05）；C D8+T细胞有升高趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。通过实验研究，我们认为“肤敏膏”的作用机理可能与其调节C D3+T、C D4+T细胞平衡有关，通过对其数量紊乱的纠正作用，从而调节细胞免疫功能以间接的干预T h1/T h2细胞分化及平衡,在过敏反应早期调节细胞免疫平衡以阻断病变进程。从而阻断过敏性皮肤病的发生、发展，从根本上改善过敏体质，以达消敏、抗敏作用。

[1] 徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，2003：1196-1200.

[2] 曾秋妹，潘祥龙.中药抗炎一号注射液治疗急性皮炎湿疹对T细胞亚群影响[J].福建医药杂志，2001，23（5）：3-5.

[3] 邓丹琪.湿疹的皮肤实验及细胞免疫功能的观察[J].中国皮肤性病学杂志，1998，11（12）：42-43.

[4] Bel linghausen I,Brand U.Comparsion of al lergen stimulated dendritic f rom atopic and nonatopic donors dissecting their ef fect on autologous nave and memory T helper cel ls of such donors[J].J Al lergy Clin Immunol,2000,105（4）:988-996.

The Influenceof FuM in Ointm enton T Lym phocytesand ItsSubsets of PCA RatModel lym phocyte

LIJingping1,LIQingsheng2,QIYan3
1 Yunnan University of TCM,Kunming 650500,China;2 Kunming Medical University；3 Yunnan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

Objective:To explore themechanism of FuM in ointment fighting against skin allergic reaction by studying itseffectson T lymphotesand itssubsetsof passive cutaneousanaphylaxis(PCA)ratmodel.Methods:PCA ratmodelwas established w ith ovalbumin,expression rates of CD3+T,CD4+T and CD8+T in peripheral blood of PCA ratswere detected by immunofluorescent flow cytometry and the effectsof FuM in ointmenton three kindsof cells.Results:Compared with themodel group,three groups of FuM in ointmentwere higher than themodel group in CD3+T, CD4+T and CD8+T cellular expression rates average values obviously(P＜0.05).Conclusion:Themechanism of FuM in ointmentmightbe related to its function of regulating CD3+T and CD4+T quantity disorder indirectly,therefore,to intervene Th1/Th2 cells differentiation and balance,regulating cellular immunity balance in allergic reaction in order to cease pathologicalprogress.

PCA ratmodel;T lymphotesand its subsets;FuM in ointment

R285.5

A

1004-6852(2015)08-0006-03

2014-10-25

李静平(1979—)女，博士学位，讲师。研究方向：临床中药学。