TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达及意义

牛蕾 雷丽

[摘要] 目的 研究TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达，揭示其在乳腺癌中的信号转导通路。 方法 应用免疫组化SABC法检测62例乳腺癌组织中TGFβ1与Smad2/3的表达情况，利用SPSS19.0统计学软件分析TGFβ1与Smad2/3的差异性及相关性。 结果 TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中呈高表达，阳性表达率依次为69.35%（43/62）和40.32%（25/62）。TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达与年龄无关，TGFβ1与Smad2/3在组织学分级、病理学分类、TNM分期方面差异均有统计学意义（P<0.05）。TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达呈正相关（r=0.261，P<0.05）。 结论 乳腺癌的发生可能与TGFβ1及Smad2/3信号转导途径发生异常，致使下游信号Smad2/3突变，增加瘤细胞与细胞外基质的相互作用、抑制免疫系统、增加血管形成等机制促进乳腺癌的浸润和转移有关。

[关键词] 乳腺癌；TGFβ1；Smad2/3；相关性

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）17-0011-03

转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGFβ）是一族能引起细胞产生表型变化、具有多种生物学功能的蛋白多肽，可调节多种正常细胞或瘤细胞的生长分化。目前研究[1，2]表明：TGFβ/Smads信号途径不仅在细胞及生物体生长和发育过程中起重要作用，而且与人体肿瘤的发生、发展有密切关联。TGFβ/Smads信号转导途径中一旦发生异常就可引起信号转导紊乱，从而导致肿瘤的发生[3]。所以探讨TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达，有利于揭示其在乳腺癌中的信号转导通路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取阜新市中心医院2004～2014年间62例乳腺癌存档标本。患者年龄27～78岁，平均49岁。组织学分级按照Elston等[4]提出的Bloom-Richardson分级（即Nottingham分级），对每例乳腺癌组织从腺管形成、核分裂数和癌细胞异型性3个方面进行评分，按所得总分进行分级：3～5 分为Ⅰ级，6～7 分为Ⅱ级，8～9分为Ⅲ级，Ⅰ级14例，Ⅱ级25例，Ⅲ级23例。病理学分类方法参照WHO1981年制定的乳腺癌分类[5]：导管内癌8例、浸润性导管癌48例、浸润性小叶癌4例、浸润性特殊癌2例。根据国际抗癌联盟（UICC）关于TNM分期方法[6]进行临床分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期32例，Ⅳ期8例。

1.2 试剂及方法

1.2.1 主要试剂 鼠抗人TGFβ1多克隆抗体，鼠抗人Smad2/3多克隆抗体（美国，Santa Cruz），SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 方法 应用免疫组织化学染色SABC法观察TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌中的表达分布情况。切片常规脱蜡至水，浸入枸橼酸盐缓冲液，然后微波加热15 min，室温冷却后PBS冲洗3次；用3%H2O2室温（10 min）灭活内源性酶，PBS冲洗3次；湿盒内滴加5%BSA封闭液，室温（20 min）甩去多余液体，不洗；滴加稀释度为1∶100的一抗，4℃过夜，PBS冲洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃下30 min，PBS冲洗3次；滴加试剂SABC，37℃下30 min，PBS冲洗4次（以上PBS浓度均为0.01 mol/L）；DAB显色，室温控制反应，蒸馏水充分洗涤；苏木素轻度复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。每次染色流程均设有对照作为染质量控制标准。阳性对照用Santa Cruz公司已证实的阳性TGFβ1与Smad2/3切片为对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，至少由2名有经验的病理医师独立观察切片。

1.2.3 结果判定 在200倍视野下随机选取5个视野，记数每个视野中肿瘤上皮细胞的染色情况，取平均值。TGFβ1与Smad2/3阳性着色位于细胞质中呈弥漫或散在的棕黄色颗粒。根据瘤组织中阳性细胞的有无及数量，将其分为阴性（-）：未见阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞少于10%；阳性（++）：阳性细胞11%～30%；强阳性（+++）：阳性细胞多于30%[7]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计学软件包进行数据分析，采用χ2检验或Fisher精确概率法分析TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌中阳性表达的差异性，Spearman相关分析TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌中阳性表达的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织TGFβ1与Smad2/3的表达情况

TGFβ1主要表达在细胞浆，呈棕褐色颗粒状（封三图1）。Smad2/3主要弥漫分布于细胞浆和细胞核，呈棕褐色颗粒状（封三图2）。表1 TGFβ1的阳性表达率为69.35%（43/62），Smad2/3的阳性表达率为40.32%（25/62）。TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达与年龄无关（P>0.05），TGFβ1与Smad2/3在组织学分级、病理学分类、TNM分期组中的表达差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 乳腺癌中TGFβ1与Smad2/3之间的关系

TGFβ1与Smad2/3均阳性为21例（33.87%）；TGFβ1阳性/Smad2/3阴性者22例（35.48%）；Smad2/3阳性/TGFβ1阴性者4例（6.45%）；TGFβ1与Smad2/3均阴性为15例（14.19%）；TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌中的表达存在正相关（r=0.261，P<0.05），见表2。

3讨论

乳腺癌的发生是由多种异常癌基因和抑癌基因共同作用的积累。癌基因的激活和抑癌基因的失活导致宿主代谢发生改变，细胞信号转导失常，从而导致细胞异常分裂诱导癌变，这是肿瘤发生的根本原因[8]。

TGFβ至少有6种异构体形式，TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，有60%～80%的序列同源[9]。各种异构体在许多生物反应中表现出相似的作用，其中TGFβ1最为重要，是人体内主要的存在形式，且具有抑制早期肿瘤发生和促进晚期肿瘤迁移扩散的作用[10，11]。Smad是Mad和Sma蛋白及其类似物的统称，即Smad（Sma-Mad）族蛋白。迄今为止，在哺乳动物已经分离鉴定的Smad 蛋白共有9种，作为TGFβ家族受体激酶的直接底物，包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8。Smad1、Smad5和Smad8主要通过BMP受体磷酸化，介导BMP反应。Smad2和Smad3被TGFβ受体磷酸化，转导TGFβ和活化素的信号。Smad4是通用型蛋白，参与Smad2和Smad3介导的信号传导。Smad6和Smad7的功能是抑制受体激动的Smads蛋白介导的信号转导，Smad6和Smad7可以阻断TGF-β介导的转录反应，有研究发现Smad7较Smad6的抑制作用更为明显[12]。

本研究证实：TGFβ1主要表达于细胞浆，Smad2/3主要弥漫分布于细胞浆和细胞核，这与Shen N等[13]研究一致，Smad2和Smad3作为TGFβ1的下游信号转导因子，转导TGFβ1的信号。TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌组织中的表达与年龄无关，这可能是不同年龄的乳腺癌中TGFβ1与Smad2/3信号转导途径已经发生异常，过表达的TGFβ1未能有效抑制肿瘤发生，致使下游信号Smad2/3突变，参与了促进肿瘤发生和扩散的作用。而在组织学分级、病理学分类、TNM分期中TGFβ1与Smad2/3阳性表达与阴性表达存在差异性，且TGFβ1与Smad2/3在乳腺癌中的表达存在正相关，说明在不同组织学分级、病理学分类、TNM分期状态下，肿瘤的浸润程度及转移程度变化可能是在TGFβ1与Smad2/3信号转导途径下发生的，其机制可能为TGFβ1活化后与细胞膜表面Ⅱ型受体结合，同时激活TβRⅡ磷酸化激酶，TβRⅠ识别此复合物并与之结合，又被TβRⅡ磷酸化激酶磷酸化而激活，作用于胞质内下游分子，开启信号的传导，激活Smad2和Smad3，将信号转导到细胞内，并作为转录因子单独或与其他DNA结合蛋白结合后激活靶基因，从而影响信号转导，增加瘤细胞与细胞外基质的相互作用、抑制免疫系统、增加血管形成等机制来促进乳腺癌的浸润和转移，同时也说明了组织学分级、病理学分类、TNM分期状态在临床应用的重要性和必要性[14]。TGFβ/Smads信号转导路径过程中可能还伴发着其他信号转导因子的调节和其他细胞因子的参与，但目前学术界基本认为其表达水平与肿瘤的发生存在正性的联系。有研究表明[15]，TGFβ1在多种肿瘤细胞中过度表达，抑制肿瘤生长，当肿瘤细胞耐受TGFβ1介导的生长抑制作用后，表现为TGFβ/Smads信号转导途径的异常，致使下游信号Smads突变及癌基因突变。Massague等[16]认为，TGFβ1通过上调或下调其细胞内信号转导分子的表达水平，以一种自身反馈调控机制在其信号终止过程中发挥重要作用。信号被细胞内信号分子从胞浆转导至细胞核内发挥作用后，TGFβ1信号需要减弱并终止，以求细胞对TGFβ1刺激反应的强度和持续时间得到精确控制。

综上所述，TGFβ/Smads信号转导途径是我们揭示肿瘤发生过程的一条非常重要线索，其中通用性Smad4在乳腺癌发生中与TGFβ1和Smad2/3之间的关系还有待我们进一步研究。

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（收稿日期：2015-03-19）