狭叶薰衣草特征指纹图谱研究

李晨阳　谭为　陈燕　赵军　徐芳

摘要：目的 建立20批狭叶薰衣草的指纹图谱。方法 采用Phenomenex ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈和0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长350 nm。通过相似度评价和主成分聚类分析对20批狭叶薰衣草进行归类。结果 提取了10个色谱峰为狭叶薰衣草的指纹图谱共有峰，指认了2个色谱峰。20批狭叶薰衣草的相似度在0.9以上，通过主成分聚类分析将20批狭叶薰衣草分为3类。结论 该方法操作简便，重复性好，建立的狭叶薰衣草指纹图谱可用于规范和控制狭叶薰衣草药材的质量。

关键词：狭叶薰衣草；高效液相色谱法；指纹图谱；迷迭香酸；主成分聚类分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.024

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0087-05

Study on HPLC Characteristic Fingerprints of Lavandula Angustifolia LI Chen-yang， TAN Wei， CHEN Yan， ZHAO Jun， XU Fang （Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China）

Abstract：Objective To establish the fingerprints of 20 batches of Lavandula Angustifolia by HPLC. Methods The determination was performed on a Phenomenex ODS-A column （250 mm× 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was in gradient elute mode with a mixture consisting of acetonitrile and 0.036 mol/L phosphate acid solution. The flow rate was 1.0 mL/min. The temperature was 30 °C. The determine wavelength was 350 nm. The fingerprints of 20 batches of Lavandula Angustifolia were compared and classified by similarity evaluation， cluster analysis， and principal composition analysis. Results Totally 10 chromatographic peaks were extracted as the common peaks of Lavandula Angustifolia， and 2 peaks were identified. The similarity degrees of the 20 batches of Lavandula Angustifolia were above 0.9. All the batches of Lavandula Angustifolia were classified into 3 categories. Conclusion The method is simple and reproducible， and can be used for the standardization and quality control of Lavandula Angustifolia.

Key words：Lavandula Angustifolia；HPLC；fingerprint；rosmarinic acid；principal composition cluster analysis

狹叶薰衣草Lavandula angustifolia Mil.为唇形科植物，20世纪初，我国从国外引种栽培成功，现已在新疆伊犁地区大面积推广种植[1-3]。狭叶薰衣草作为新疆特有的芳香类植物，无论在药理活性还是临床应用上都有很高的价值[4-6]。为进一步提高狭叶薰衣草药材质量的可控性，我们在对狭叶薰衣草中迷迭香酸含量测定的基础上，以迷迭香酸为对照建立狭叶薰衣草的标准指纹图谱[7]。本研究考察20个不同产地及批次的狭叶薰衣草，结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，并建立狭叶薰衣草标准指纹图谱，通过

基金项目：新疆维吾尔自治区卫生厅青年科技人才专项科研 项目（2013Y04）

通讯作者：徐芳，E-mail：xufangxj@163.com

相似度评价和主成分聚类分析对20批不同产地的狭叶薰衣草药材进行分析归类，以提高狭叶薰衣草药材质量控制水平，促进狭叶薰衣草的深入开发。

1 仪器与试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪、SPD-10Avp紫外可见检测器（日本岛津有限公司）；梅特勒AL-204型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；AS10200AD型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

乙腈，色谱纯，Fisher公司；水，娃哈哈纯净水；磷酸等其他试剂为国产分析纯。迷迭香酸对照品（批号MUST-1202702，纯度≥98%），成都曼斯特生物科技有限公司。木犀草苷对照品（批号111720-201106），中国食品药品检定研究院。20批狭叶薰衣草药材采自不同地区或从不同市场购买（见表1），经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为狭叶薰衣草Lavandula angustifolia Mill.的干燥花。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脱（0→20→50→55→60 min，乙腈10%→15%→22.5%→40%→10%）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：350 nm；進样量：10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取狭叶薰衣草药材，粉碎（过40目筛），取约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为70%甲醇100 mL，超声（功率280 W，频率25 kHz）提取1 h，过滤，将滤液减压浓缩后移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.129 6 mg的迷迭香酸对照品溶液。取木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.081 6 mg的木犀草苷对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一份狭叶薰衣草药材的供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，以迷迭香酸色谱峰为对照，比较各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间计算结果均RSD<1.0%，占总峰面积百分比5%以上的共有峰相对峰面积均RSD<3%，表明本方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批狭叶薰衣草药材6份，分别按供试品溶液制备方法制备，进样，记录色谱图，以迷迭香酸色谱峰为对照，比较各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间计算结果均RSD<1.0%，占总峰面积百分比5%以上的共有峰相对峰面积均RSD<3%，表明本方法的重复性符合要求。

2.4.3 稳定性试验 取同一份狭叶薰衣草药材的供试品溶液，分别在0、1、5、7.5、24、32 h进样，记录色谱图，以迷迭香酸色谱峰为对照，比较各主要共有峰的相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间计算结果均RSD<1.0%，占总峰面积百分比5%以上的共有峰相对峰面积均RSD<3%，表明供试品溶液在32 h内稳定性符合测试要求。

2.5 狭叶薰衣草对照指纹图谱的建立

采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对20批不同产地及批次狭叶薰衣草的色谱图进行相似度评价。发现10个共有色谱峰（见图1），其中峰8为木犀草苷，峰10为迷迭香酸（见图2）。共有特征峰占总峰面积的90%以上，20批次不同产地狭叶薰衣草相似度评价结果见表2。

2.6 聚类分析

以狭叶薰衣草药材指纹图谱中标定的共有峰的相对峰面积为变量，运用SPSS19.0统计软件，采用欧氏距离进行聚类分析[8]，结果见图3。

根据药材聚类分析的结果将狭叶薰衣草药材大致分为3类。Ⅰ类包括X17、X20、X12、X14、X18、X19、X3，多采收于2012年、2013年；Ⅱ类包括X4、X6、X15、X16、X1、X11、X2、X5、X7、X8，采收于2010年、2011年；Ⅲ类包括X9、X10、X13，采收于2011年。综合聚类分析提示其成分差异可能与药材的采收及存放时间有关。

2.7 主成分分析

对20批狭叶薰衣草药材样品的10个共有峰采用SPSS19.0统计软件对原始数据做标准化处理后进行主成分分析，前3个主成分的特征根>1，其贡献率达79.598%，主成分分析结果见表3。

药材主成分分析旋转后的公共因子载荷矩阵见表4，每一个载荷量表示主成分与对应变量的系数，经计算可得主成分的模型。A1、A2、A3分别表示3个主成分，F1，F2……F10分别表示各个色谱峰的峰面积经标准化后的数据。

由旋转后的公共因子载荷矩阵可以看出，第1主成分主要反映了来自峰3、6、9、1、2的影响；第2主成分主要反映了来自峰10、5、7的影响，大多为迷迭香酸；第3主成分主要反映了来自峰8的影响，即木犀草苷；1～7、9均为未知峰，待进一步确认。

3 讨论

本研究考察了以不同溶剂（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和70%乙醇）为提取溶剂，采用超声提取法，以狭叶薰衣草的峰面积和峰形为判断依据，结果表明以70%甲醇提取效果最佳。在提取方法研究中，考察了加热回流法和超声提取法对指纹图谱测定的影响，结果表明，2种提取方法的色谱图大体一致，但超声提取法操作更为简便快捷，故选择超声提取法。同时对提取时间（30、45、60 min）进行考察，最终确定“2.2”项下供试品溶液的制备方法。在流动相选择中，考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液的梯度洗脱系统，结果表明，乙腈对狭叶薰衣草样品中各成分的分离度和峰形更好，因此采用乙腈-磷酸水溶液系统。

狭叶薰衣草作为新疆维吾尔医常用药材，尚未见关于其指纹图谱的研究，为加强对地产狭叶薰衣草的质量控制，本研究采用HPLC测定了20批次新疆不同产地狭叶薰衣草药材，提取了10个色谱峰为狭叶薰衣草的指纹图谱共有峰，指认了其中的2个色谱峰，样品的相似度在0.9以上，说明20批狭叶薰衣草的质量较均一。指纹图谱中的10个共有峰相对保留时间符合程度好，相对面积略有差异，表明批次间各成分含量的相对比值有所不同，即使是同一产地，峰面积比值也有差别，这可能是受环境、水源和土壤等因素的影响。本试验采样基数充足、范围广，涵盖地产狭叶薰衣草多数产地。聚类分析将20批狭叶薰衣草分为3类，提示分类可能与药材的采收时间有关。主成分分析筛选出共有的特征成分，分析结果指出主要影响要素。2种分析方法结合使用，互相支撑，互相依托，弥补了相似度评价指纹图谱的不足，也为狭叶薰衣草质量标准的提高及规范狭叶薰衣草药材市场提供了依据。

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（收稿日期：2014-10-09；编辑：陈静）