蜈蚣败毒饮药物血清对银屑病HaCaT细胞凋亡相关基因表达的影响

杨素清 刘畅　张海龙　安月鹏

摘要：目的 探讨蜈蚣败毒饮对银屑病HaCaT细胞凋亡相关基因Bcl-2、核因子-κB（NF-κB）mRNA表达的影响。方法 实验大鼠随机分为空白对照组、西药对照组、中药对照组和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量组，分别给予生理盐水、甲氨蝶呤混悬液、复方青黛胶囊混悬液和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量浓缩液灌胃，制备相应的药物血清，将其分别作用于HaCaT细胞中培养传代，采用RT-PCR法检测不同药物血清对目的基因表达的干预作用。结果 各组药物血清均能够降低HaCaT细胞Bcl-2、NF-κB mRNA的表达，蜈蚣败毒饮高剂量组和西药对照组的作用效果最为明显，且蜈蚣败毒饮各剂量组呈现出一定的量效关系。结论 蜈蚣败毒饮可能通过降低Bcl-2、NF-κB mRNA的表达促进了HaCaT细胞凋亡，调控T细胞相关因子降低免疫反应，从而发挥抗银屑病样的作用。

关键词：银屑病；蜈蚣败毒饮；HaCaT细胞；细胞凋亡抑制因子；核因子

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.016

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0055-04

Effects of Wugong Baidu Drink Drug-containing Serum on Expressions of Genes Related to the Apoptosis of HaCaT Cell in Psoriasis YANG Su-qing， LIU Chang， ZHANG Hai-long， AN Yue-peng （First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To discuss effects of Wugong Baidu Drink on expressions of Bcl-2， NF-κB mRNA genes related to the apoptosis of HaCaT in psoriasis. Methods Wistar rats were randomly divided into 6 groups：blank group， Western medicine control group， TCM control group， and Wugong Baidu Drink high， medium， and low dose groups. They were given normal saline， methotrexate suspension， compound natural indigo capsule suspension， and the different doses of Wugong Baidu Drink for gavage， respectively. Drug-containing serum of each group was prepared， and was put in the HaCaT respectively to subculture. The intervention effect of different Drug-containing serums on expressions of objective genes were detected through PR-PCR method. Results Drug-containing serum of each group could decrease the expressions of Bcl-2 mRNA and NF-κB mRNA. The most obvious effects were shown in the groups of Western medicine control group and Wugong Baidu Drink high dose group. All Wugong Baidu Drink groups showed a dose-response relationship. Conclusion Wugong Baidu Drink probably can promote the apoptosis of HaCaT by reducing the gene expressions of Bcl-2 and NF-κB. It can also decrease immune response by regulating serum factors related to T cells to play the role of anti-psoriasis.

Key words：psoriasis；Wugong Baidu Drink；HaCaT cell；inhibiting factor of apoptosis；nuclear factor

銀屑病是一种常见的、反复发作的慢性炎症性皮肤病，目前普遍认为其发病机制与HaCaT的高度异常

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12531619）

通讯作者：安月鹏，E-mail：anyuepeng_021@163.com

增殖密切相关[1]，因HaCaT细胞的加速增殖，导致表皮更替时间缩短，从而导致皮肤角化过度及红斑、鳞屑等现象产生。我们前期对HaCaT细胞增殖相关基因角蛋白-6（Keratin-6）进行研究发现，这种基因的表达水平与表皮细胞的增殖存在正相关作用[2]。但皮肤细胞的代谢是增殖和凋亡双方面调控的共同结果，在与表皮细胞凋亡相关基因中，细胞凋亡抑制基因Bcl-2和核因子-κB（NF-κB）起到了十分重要的作用，均可通过表达而抑制细胞凋亡，延长HaCaT细胞的寿命，导致表皮增厚，最终形成银屑病样反应。故本研究选择以上2种基因的表达作为研究对象，同时结合蜈蚣败毒饮组方依据的中医毒瘀理论，探讨中药对于银屑病表皮细胞“抑制增殖”和“促进凋亡”的双向调控机能。

1 实验材料

1.1 动物与细胞株

雄性Wistar大鼠36只，体质量180～220 g，鼠龄6～8周，黑龙江中医药大学动物实验中心提供（动物合格证号：医动字第09-3-3号）；HaCaT细胞株来源于武汉大学实验保藏中心。

1.2 试剂

无菌蒸馏水（TA6007，北京天安联合科技有限公司），异丙醇、氯仿、戊巴比妥钠、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS，济南世纪通达化工有限公司），Trizol Reagent、DEPC、引物设计合成（上海浩然生物技术有限公司），DL2000 DNA Marker、TransScript Reverse Transcriptase（上海捷瑞生物工程有限公司），2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式生物技术有限公司）。

1.3 仪器

细胞培养瓶、细胞培养板（美国康宁公司），细胞培养箱（德国Binder公司），DMEM培养基（上海慧颖生物科技有限公司），超低温冰箱（8600，美国Thermo Scientific），倒置显微镜（CX22，日本Olympus），电泳仪（TE70X，美国Hoefer），高速低温离心机（MR18.2，德国Herolab），台式离心机（XPN-100，美国Optima），凝胶成像分析系统（MSD-2000A，北京麦思奇高科技有限公司），PCR仪（PQ9000，德国analytikjena），超净工作间（黑龙江中医药大学中基实验室）。

2 实验方法

2.1 药液制备

蜈蚣败毒饮（蜈蚣3 g、紫草30 g、鬼箭羽30 g、土茯苓30 g、乌梢蛇20 g、甘草10 g，药物均购自黑龙江中医药大学附属第一医院门诊草药局），药物经2次煎煮，先加8倍量水，经4 h浸泡后煎煮1 h，再加6倍量水煎煮1 h，2次煎汁混合均匀，分别浓缩为浓度5.94、2.97、1.48 g/mL。甲氨蝶呤片（批号070803，上海信谊药厂有限公司），取15 mg溶于134.41 mL无菌蒸馏水，配制0.11 mg/mL甲氨蝶呤混悬液；复方青黛胶囊（批号201207013，陕西医药控股集团），取18 g药物剂量的胶囊制剂溶解于134.43 mL的无菌蒸馏水，配制成0.13 g/mL复方青黛胶囊混悬液。

2.2 药物血清提取

将Wistar大鼠随机分为空白对照组、西药对照组、中药对照组和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量组，每组6只。空白对照组灌服生理盐水，西药对照组灌服甲氨蝶呤混悬液，中药对照组灌服复方青黛胶囊混悬液，蜈蚣败毒饮低剂量组、中剂量组、高剂量组灌服相应浓度的蜈蚣败毒饮浓缩液。灌服剂量均为每日2 mL/100 g，每日2次，连续3 d。末次给药后，大鼠戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉，取腹主动脉血静置后3000 r/min离心5 min分离血清，取上层血清，经56 ℃灭活，混匀，滤菌，分装，保存。

2.3 细胞分组与给药

将HaCaT细胞置于DMEM培养液中进行细胞培养，经传代、计数、冻存、复苏等过程进行实验用细胞的制备。将HaCaT细胞随机分成6组，并取细胞以2×104/mL接种于培养瓶中，每瓶4 mL，培养24 h后，显微镜下观察细胞已贴壁生长良好，再吸弃上清液和没有贴壁的细胞，分别给予空白血清、甲氨蝶呤药物血清、复方青黛胶囊药物血清和蜈蚣败毒饮低、中、高剂量血清于6个瓶中，并按照比例加入胎牛血清、DMEM，使其与药物血清的比例保持在1∶8∶1，处理48 h。

2.4 观察指标和检测方法

2.4.1 RNA提取及检测 应用Trizol试剂盒提取细胞总RNA。将培养瓶内的培养液倒出，用预冷的PBS缓冲液清洗细胞表面3次，按1 mL/25 cm2加入Trizol，反复吹打后移入新的DEPC处理过的Eppendorf管内。室温下孵育细胞5 min，使核蛋白完全碎裂。按照每1 mL Trizol加入0.2 mL的比例加入氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡混匀30 s，室温下孵育2～3 min，4 ℃、12 000 g离心10～15 min。Eppendorf管内液体分为3层，小心吸取最上层的水性上清，加入异丙醇0.5 mL，颠倒混匀，室温孵育10 min后，4 ℃、12 000 g离心10 min，RNA沉淀管底，呈胶冻状。弃上清，保留沉淀，加入4 ℃的75%乙醇，每1 mL Trizol至少加入1 mL乙醇，并振荡。2～8 ℃、7500 g离心5 min，小心吸弃上清后空气干燥3～5 min，加入10 μL DEPC水，吹打溶解RNA，進行纯度及完整性检测，或冻存于-70 ℃冰箱备用。

2.4.2 第一链cDNA合成 加入总RNA 500 ng， Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，Ribonuclease Inhibitor（50 U/μL） 0.5 μL，TransScript RT 1 μL， ddH2O to final volume 20 μL。轻轻混匀，42 ℃孵育30 min。85 ℃加热5 min失活。

2.4.3 聚合酶链反应 引物：从美国NCBI数据库下载mRNA序列，用Primer3.0引物设计软件设计：Bcl-2（Forward primer：CTGGGGGAGGATTGTGGCCTTCT； Reverse primer：CTCCAACCCCCGCATCTCGGAC；产物长度220 bp）；NF-κB（Forward primer：CGCCACCCGGCT TCAGAATGG；Reverse primer：TATGGGCCATCTGCTGTTGGC AG；产物长度148 bp）；ACTB（Forward primer：ACAGAG CCTCGCCTTTGCCGATC；Reverse primer：ATCCTTCTGACC CATGCCCACCA；产物长度208 bp）。反应体系：Template DNA 2 μL，Forward Primer（10 μmol/L） 1 μL；Reverse Primer（10 μmol/L） 1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O to final volume 50 μL。PCR循环：94 ℃预变性4 min、94 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，连续30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

2.4.4 PCR产物分析 应用凝胶图像处理系统对电泳后的凝胶进行观察、拍照，测量各产物的光密度。以目的基因光密度值与同时扩增的内参基因光密度比值表示目的基因的相对表达水平。实验重复5次。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统計软件进行分析。计量资料以—x±s表示，多组计量资料的两两比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

与空白对照组比较，各药物组对HaCaT细胞Bcl-2、NF-κB mRNA表达均有干预作用（P<0.05）；其中西药对照组干预作用优于除蜈蚣败毒饮高剂量组外各给药组（P<0.05），且蜈蚣败毒饮高剂量组与西药对照组药效相当（P<0.05）。蜈蚣败毒饮各剂量组作用疗效随药液浓度的增加而增强。通过凝胶电泳图可以直观看出两目的基因的表达成像情况。

5 讨论

银屑病临床突出表现为大量的红斑、鳞屑堆积。以往对于银屑病发病机制的研究多集中于对HaCaT细胞增殖机制的探讨[3]，从正向思维认为，增殖的过度必然会导致表皮堆积成厚层银屑。但这仅仅是其中的一个方面，凋亡的抑制和减慢同样可造成内表皮细胞数量的增多而发病。

HaCaT细胞凋亡在皮肤发育和更新平衡稳定中起着重要的作用，与其增殖密切相关。在正常表皮，角质形成细胞增殖速率与凋亡速率相等，以维持表皮细胞的动态平衡。多数学者认为，银屑病中角质形成细胞的凋亡受阻，其凋亡的减少可造成多余细胞堆积及角层增厚[4]。有学者比较了银屑病来源的角质形成细胞和正常人角质形成细胞对凋亡反应的差异，发现银屑病来源的角质形成细胞对凋亡具有抵抗性[5]。细胞凋亡的发生和发展是多基因严格控制的过程，Bcl-2是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，是目前发现的与凋亡关系密切的原癌基因之一，也是细胞凋亡过程中的一类调节因子[6]。Bcl-2的表达可调节细胞对凋亡的易感性，增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗性，抑制许多细胞的凋亡，同时，可延长具有分化潜能的上皮细胞的寿命且允许增殖、分化和形态发生发展，从而导致表皮增厚。NF-κB在银屑病发病过程中亦起到了关键的作用，实验研究表明，NF-κB介导的对细胞凋亡的抑制包括诱导超氧化物歧化酶表达、诱导凋亡抑制因子表达这两个主要功能[7]，同时，NF-κB亦具有调控T淋巴细胞所介导的多种细胞因子及黏附分子表达的作用，通过干预这些血清学因子的含量从而影响银屑病的发展发生[8]。

本研究结果显示，甲氨蝶呤、复方青黛胶囊、蜈蚣败毒饮药物血清均有降低HaCaT细胞Bcl-2、NF-κB mRNA表达的作用，与空白对照组比较差异均有统计学意义；同时，蜈蚣败毒饮高剂量组和西药对照组的作用效果明显优于其他各药物组，并且蜈蚣败毒饮药物血清的作用强度随着浓度的增高而表现出一定的不典型量效关系。因此我们推测，基于中医毒瘀理论而创立的蜈蚣败毒饮在中医学角度上可以产生良好的解毒化瘀之效，将热毒、湿毒、瘀毒随因而解，以防疾病的转化和变归。而在病因学角度其发挥抗银屑病作用机制方面，一是可能与抑制了HaCaT细胞增殖相关；另一方面是通过降低Bcl-2、NF-κB基因的表达，促进了HaCaT细胞凋亡；再者，与其干预和调节T淋巴细胞相关因子，降低免疫反应有关。蜈蚣败毒饮通过多途径、多靶点的作用机制来达到治疗银屑病的目的，体现出中医药的多点优势和双向调控作用。

参考文献：

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[2] 杨素清.蜈蚣败毒饮治疗银屑病的临床研究及对HaCaT、HUVEC细胞增殖和相关基因表达的影响[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2011.

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[7] 廖君，张薇，夏兴，等.脑泰方对局灶性脑缺血大鼠脑组织核因子-κB、基质金属蛋白酶9及其抑制剂表达的影响[J].中国中医药信息杂志， 2013，20（9）：28-30.

[8] 邵依，李红文，郑乃刚，等.寻常性银屑病患者皮损NF-κB，IL-6，p16， DNMT1和HDAC1表达及共表达的关系[J].中国皮肤性病学杂志，2012， 26（10）：875-879.

（收稿日期：2014-06-29；编辑：华强）