鸭胚大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的分离鉴定与药敏分析

王苗利 陈静 李玉杰 徐鸿 曹振山

摘  要：2015年4月，滨州市无棣县某鸭场最近出现鸭胚孵化率下降，死胚率达到30%。实验室对送检的3枚鸭胚进行了细菌分离、生化鉴定及药敏分析。通过对鸭胚的细菌分离纯化，得到两种细菌，均为革兰氏阴性杆菌;通过对两种细菌生化鉴定，结果为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌;对两种菌进行药敏分析，根据药敏结果对鸭场进行科学用药，降低滥用药、过度用药对鸭场带来的危害。

关键词：鸭胚;细菌分离;生化鉴定;药敏分析;大肠杆菌;肺炎克雷伯菌

中图分类号：S858.325.1     文献标识码：B     文章编号：1673-1085（2015）06-0010-03

大肠杆菌病是养鸭场最常见的细菌病之一。大肠杆菌既可以水平传播，也可以垂直传播，主要引起鸭的卵黄吸收不全、心包炎、气囊炎、肝周炎[1]，本菌由于很容易产生耐药性，实际生产中感染途径及感染原因不一，临床治疗越来越复杂。

肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界，该菌近年来成为仅次于大肠杆菌的最重要的条件致病菌[2-4]，主要存在于人和动物肠道、呼吸道、泌尿生殖道。肺炎克雷伯菌可在全身各部位发生感染，但最高的发病率在尿路和呼吸道。

近年来，禽病感染发病原因越来越复杂，混合感染越来越常见，再加上抗生素的滥用，细菌的耐药性越来越强，给临床诊断带来了很大的困难。因此，根据实验室诊断以及科学的药敏分析，合理的指导用药治疗，成为今后发展的趋势，相信如果广大养殖用户都能科学、合理的用药，一定会改善抗生素滥用、细菌耐药性增强的现象，减少抗生素给禽以及人类带来的危害，更好地应对禽场的疫病防控。

1  发病情况

2015年4月份，滨州市无棣县某鸭场最近出现了鸭胚在孵化过程中死亡情况，经过了解，场内种鸭正常，无明显症状，之前受精卵、孵化率均正常，大约28日出壳;但最近一批鸭胚孵化至24d落盘后，至第26天开始出现死胚。实验室接到场主送检的样本后，立即开展检验，并根据检验结果指导用药，得到了良好效果。

2  试验材料与方法

2.1  试验材料  科马嘉显色培养基，营养琼脂，革兰氏染色液，奥林巴斯显微镜，梅里埃生化及药敏仪VITEC2。

2.2  试验方法

2.2.1  病料接种  无菌操作，将鸭胚表面用酒精和碘酊消毒;从蛋壳气室一端敲一小孔，用无菌棉棒伸入蛋内至卵黄，沾取病料接种于显色培养基上，接种完后将平皿倒置放于温箱中，37℃培养18～24h。

2.2.2  细菌染色镜检及分离纯化  挑取显色平板上培养出的细菌进行革兰氏染色，染色步骤为：结晶紫溶液染色1.5min后，清水洗净;革兰氏碘液酶染1.5min后，清水洗净;酒精脱色40s后，清水洗净;最后用复红溶液染色20s后，清水洗净。将玻片自然晾干，在目标区域滴加松柏油，100倍油镜观察细菌形态。

结合镜检结果及培养基培养出的细菌颜色、形态的不同，挑取单菌落，三线划线法纯化到营养琼脂平板上，将营养琼脂平板倒置放于温箱中，37℃培养18～24h。

2.2.3  细菌鉴定及药敏分析  将纯化的营养平板取出，置于超净台内，根据染色镜检结果，选择合适的鉴定、药敏卡片;无菌操作，分别挑取单菌落接种于3ml 0.45%氯化钠溶液中，菌悬液浓度控制在0.5～0.63Mc浓度，备装鉴定卡片;浓度调好后，无菌吸取250μl菌悬液于新的3ml 0.45%氯化钠溶液中，备装药敏卡片;将鉴定卡片和药敏卡片分别插入制备好的菌悬液中，做好标记，装载上机，5～18h后读取结果。

3  结果与分析

3.1  病料接种培养结果  经过温箱37℃培养18～24h后，取出平板，观察到平板上长出两种细菌，分别为紫红色和蓝色的菌落。

3.2  细菌染色镜检结果  经过革兰氏染色，确定平板上长出的细菌为两种，均为革兰氏阴性杆菌。

3.3  细菌生化鉴定及药敏分析  生化鉴定结果见表1、表2，根据镜检结果，选择GN革兰氏阴性杆菌鉴定卡片和GN13革兰氏阴性杆菌药敏卡片，制备菌悬液并上机;经过鉴定和药敏分析，鉴定结果为大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，药敏结果见表3、表4。

由表1可知，生化结果符合大肠杆菌生化谱，置信度极好的鉴定结果，符合率为99%;由表2可知，生化结果符合肺炎克雷伯菌生化谱，置信度极好的鉴定结果，符合率为98%;由表3可知，此大肠杆菌首选药依次为厄他培南、庆大霉素、妥布霉素，由表4可知，此肺炎克雷伯菌首选药依次为环丙沙星、左氧氟沙星、厄他培南、庆大霉素。

4  讨论

结合此次药敏试验的结果，以及考虑较小的血药浓度，建议此鸭场选择庆大霉素治疗，血药浓度控制在1μg/ml，防止滥用药、过度用药，造成微生物生态失衡、耐药菌株的增加的现象。

另外，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌是常见的传染性病原菌，建议养殖场在日常中注意生物安全的科学管理，舍内、舍外定期消毒，减少病原菌的繁殖;及时清理病死禽及粪便，并做无害化处理;定期对场内鼠类等动物进行灭杀;减少外来兽医等人员带来的感染风险;减少与场外禽类的接触风险。

参考文献：

[1]  宋修庆.鸭场大肠杆菌病的危害与防治[J].兽医导刊，2011（10）：30-31.

[2]  Ronald A.The ctiology of urinary tract infection：traditional and emerging pathogens[J].Dis Mon，2003，49（2）：71-82.

[3]  Craven DE.What is healthcarc-associated pneumonia，and how should it be treated？[J].Curr Opin Infect Dis，2006，19（2）：153-160.

[4]  Gupta A.I lospital-acquired infections in the neonatal intensive care unit-Klebsiella pneumonia[J].Semin Pcrinatol，2002，26（5）：340-345.