人工虫草与冬虫夏草HPLC特征图谱研究

张薇薇等

摘要：目的 以人工北虫草、发酵虫草菌粉和冬虫夏草为研究对象，建立高效液相色谱（HPLC）特征图谱。方法 采用超声法提取虫草中的水溶性成分，HPLC建立虫草的特征图谱。采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液（B），梯度洗脱（0～16 min，0%A；16～38 min，0%→10%A；38～58 min，10%→15%A；58～65 min，15%→0%A），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长260 nm，进样体积20 μL。运用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，建立人工虫草与天然虫草HPLC特征图谱，同时指认了7个核苷类成分，并进行比较研究。结果 本方法精密度、重复性、稳定性良好。以腺苷为参照峰，对11批冬虫夏草、10批人工北虫草和12批发酵虫草菌粉进行指纹图谱分析结果显示，其指纹图谱相似度分别为0.889～0.982、0.781～0.980、0.502～0.970。结论 天然虫草的指纹图谱相似度较高，人工北虫草和发酵虫草菌粉指纹图谱的相似度较低。本方法可作为评价人工虫草和天然虫草质量的参考依据。

关键词：人工北虫草；发酵虫草菌粉；冬虫夏草；指纹图谱；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.025

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）08-0092-05

Comparative Research on HPLC Characteristic Fingerprint of Cultured Cordyceps Militarise and Cordyceps Sinensis ZHANG Wei-wei， GONG Tao， HAN Dong-he （Beijing Clinical Medicines Institute， Beijing 100035， China）

Abstract：Objective To establish fingerprints of cultured Cordyceps Militaris， Cordyceps Sinensis and Fermental Cordyceps. Methods Water soluble components in Cordyceps Sinensis were extracted by ultrasonic method. The characteristic fingerprints were established by HPLC， with Agilent ZORBAX SB-Aq （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） as column and acetonitrile （A）-0.04 mol/L KH2PO4 （B） as mobile phase；gradient elution （0-16 min， 0%A；16-38 min， 0→10%A；38-58 min， 10%→15%A；58-65 min， 15→0%A）；the flow rate was 1.0 mL/min；column temperature was 25 ℃；the detection wavelength was 260 nm；the injection volume was 20 μL. The HPLC characteristic fingerprint of mycelium was developed， and the components of adenosine， uridine， guanosine， inosine， uracil， adenine and cordycepin were identified and compared. Results This method is with high degree of precision， good repeatability and stability. With adenosine as reference peak， similarity of 11 batches of Cordyceps Sinensis collected from different habitats， 10 batches of cultured Cordyceps Militarise and 12 batches of Fermental Cordyceps were 0.889- 0.982， 0.781-0.980 and 0.502-0.970， respectively. Conclusion There were good similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the eleven samples of Cordyceps Sinensis. There were low similarities between the standard fingerprint and each fingerprint of the ten samples of cultured Cordyceps Militaris and the twelve samples of Fermental Cordyceps. This method can be reference base for the evaluation of quality of cultured Cordyceps Militaris and Cordyceps Sinensis.

Key words：cultured Cordyceps Militaris；Fermental Cordyceps；Cordyceps Sinensis；fingerprint；HPLC

基金项目：北京市中医药科技发展基金项目（JJ2009-14）

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis （Berk） Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，具“保肺益肾，止血化痰，已劳嗽”之功，主产于我国青海、西藏、四川、云南等省海拔3500～5000 m的高原高寒草甸。药理研究表明，冬虫夏草具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种药理作用[1]。近年来，从天然北虫草中分离得到拟青霉Paecilomyces militaris的菌种，经人工培养获得人工北虫草。采用天然虫草真菌发酵法获得人工虫草菌粉。冬虫夏草人工培养物制剂已广泛应用于临床[2-6]。虫草的物质基础丰富，含有氨基酸、核苷类、虫草多糖、虫草酸、甾醇类等。目前，冬虫夏草及人工虫草的质量控制尚无统一方法。本研究建立虫草高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法，通过分析人工虫草和冬虫夏草中水溶性成分的特征图谱，研究人工虫草和天然虫草的成分差异及质量状况，为虫草的质量控制及进一步开发利用虫草资源提供依据。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），Solution工作站，SPD-20A 检测器，Agilent ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；METTLER TOLEDO XP105 电子分析天平；Millipore Milli-Q Plus超纯水系统；KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Anke TGL-16C高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

对照品腺苷（批号110879-200202）、肌苷（批号1406692-201104）、虫草素（批号858-200202）购于中国食品药品检定研究院，尿苷（批号030M5309V）、鸟苷（批号120M1018V）、腺嘌呤（批号021M0181V）、尿嘧啶（批号080M0067V）购于SIGMA-ALDRICH；乙腈（HPLC Grade），美国Fisher Scientific；水为超纯水。

冬虫夏草药材：冬虫夏草1（西藏），冬虫夏草2～5（购于北京白塔寺药店），冬虫夏草6～10（购于北京同仁堂药店），冬虫夏草11（青海），由北京市卫生局临床药学研究所中药化学室鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》要求。人工北虫草：北虫草1（北京市卫生局临床药学研究所），北虫草2（吉林蚕业研究所），北虫草3（山东烟台惠众生物科技有限公司），北虫草4～10（购于北京超市）。发酵虫草菌粉：百令胶囊1～6[青海珠峰虫草药业有限公司，批号20120201 （0.5 g/粒）、20120202（0.5 g/粒）、20120203（0.5 g/粒）、20120201（0.2 g/粒）、20120202（0.2 g/粒）、20120203 （0.2 g/粒）]，百令胶囊7～12（杭州中美华东制药有限公司，批号101041、091222、090425、100147、100551、110437）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），流动相A为乙腈、B为0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液，梯度洗脱（见表1），检测波长260 nm，柱温25 ℃，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取尿嘧啶、尿苷、肌苷、鸟苷、腺嘌呤、腺苷、虫草素对照品，加0.5%磷酸溶液制成每1 mL分别含0.000 230 4、0.010 54、0.003 246、0.010 15、0.000 212 8、0.010 66、0.017 42 mg的混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取冬虫夏草1、北虫草1、百令胶囊[批号20120201（0.5 g/粒）]各0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.5%磷酸溶液50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用0.5%磷酸溶液补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液，12 000 r/min离心5 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 空白试验

取0.5%磷酸溶液作为空白溶液，按“2.1”项下色谱条件进样20 μL，记录色谱图。对照品、供试品及空白溶液色谱图见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1、3、5、10、20 μL注入液相色谱仪，在“2.1”项色谱条件下测定，记录峰面积积分值。分别以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数（r），结果见表2。

2.5.2 精密度试验 取北虫草1，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，考察仪器的精密度。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对6次进样获得的HPLC色谱图进行评价。结果表明，各色谱峰相似度在0.985～0.999之间，以腺苷作为参照峰，14个共有峰相对保留时间均RSD<0.34%，相对峰面积均RSD<2.82%，提示精密度良好。

A

1.尿嘧啶；2.尿苷；3.肌苷；4.鸟苷；5.腺嘌呤；6.腺苷；7.虫草素

2.5.3 重复性试验 取北虫草1（6份），每份0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，考察方法的重复性。结果表明，各色谱峰相似度在0.978～0.999之间，14个共有峰相对保留时间均RSD<0.26%，相对峰面积均RSD<3.78%，表明重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、4、8、12、16、20、24 h进样分析，记录色谱图，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，各色谱峰相似度在0.992～0.998之间，14个共有峰相对保留时间均RSD<0.48%，相对峰面积均RSD<3.49% ，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 特征图谱的构建及分析

2.6.1 人工北虫草的特征图谱 取10批北虫草，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件分析、记录10 批北虫草的色谱图，采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》对10批样品HPLC色谱图进行多点校正，自动匹配（时间宽度为0.10），用中位数法生成对照图谱R（即共有模式图），计算相似度，建立北虫草的特征图谱，通过软件计算，在检测到的74个色谱峰中，确定了14个共有峰，占总峰面积的57.56%，相似度为0.781～0.980。10批人工北虫草色谱图及特征图谱见图2。

2.6.2 冬虫夏草的指纹图谱 以11批冬虫夏草为研究对象，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录11批冬虫夏草的色谱图，在检测到的104个色谱峰中，确定了23个共有峰，占总峰面积的72.38%，相似度为0.889～0.982，11批冬虫夏草色谱图及特征图谱见图3。

2.6.3 发酵虫草菌粉的指纹图谱 以12批百令胶囊（发酵虫草菌粉）为研究对象，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录12批百令胶囊的色谱图，在检测到的124个色谱峰中，确定了39个共有峰，占总峰面积的81.87%，相似度为0.502～0.970，12批百令胶囊色谱图及特征图谱见图4。

3 讨论

按“2.3”项下方法制备供试品溶液，利用DAD检测器进行紫外全波长扫描，表明样品在260 nm处吸收较强。对254、260、270 nm波长检测的色谱图进行比较，结果以260 nm波长处检出色谱峰最多，且峰面积均较大，基线平稳，分离度较好。本着指纹图谱确认应遵循信息量最大化的原则，以260 nm为检测波长。

试验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.04 mol/L磷酸二氢钾水溶液等系统作为流动相，结果显示，乙腈-0.04 mol/L磷酸二氢钾水溶液作为流动相，分离效果较好，峰形对称，基线稳定，最终选择流动相为乙腈（A）-0.04 mol/L磷酸二氢钾溶液（B），梯度洗脱。

试验分别考察以水、20%甲醇、0.5%磷酸溶液为溶媒，结果表明，以0.5%磷酸作为提取溶媒，提取完全，提取溶液稳定性好。在提取方式的选择上，对比了超声提取、热回流提取2种方法，结果表明，超声提取所得提取液的色谱峰数目较多，提取率高，操作简便，较好体现了虫草水溶性成分的构成，故选择超声处理的方式提取虫草中的水溶性成分进行指纹图谱研究。

对10批人工北虫草和11批冬虫夏草的HPLC图谱数据分析处理结果显示，在检测到的133个色谱峰中，确定了5个共有峰，占总峰面积的11.52%，相似度为0.137～0.779，二者的指纹图谱相似度很低，提示其有效成分的构成存在较大差异。对12批百令胶囊和11批冬虫夏草的HPLC图谱数据分析处理结果显示，在检测到的169个色谱峰中，确定了14个共有峰，占总峰面积的40.49%，相似度为0.407～0.932。表明发酵虫草菌粉与冬虫夏草的指纹图谱相似度高于人工北虫草，表明发酵虫草菌粉有效成分的构成及含量更接近于天然虫草。对10批人工北虫草和12批百令胶囊的HPLC图谱数据分析处理结果显示，在检测到的156个色谱峰中，确定了6个共有峰，占总峰面积的 16.80%，相似度为0.163～0.889，二者的指纹图谱相似度较低，表明人工北虫草和发酵虫草菌粉有效成分的构成及含量差异较大。

本试验建立的虫草HPLC特征图谱为虫草质量评价提供了参考依据。人工虫草与天然虫草的指纹图谱存在一定差异。不同产地冬虫夏草之间的相似度较好，其中有效成分尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷及碱基类成分尿嘧啶和腺嘌呤的含量较高，质量比较稳定。人工北虫草和发酵虫草菌粉因菌种的差异、培养条件和发酵工艺不同，导致其指纹图谱的相似度较低，特征图谱中各色谱峰相对峰面积有较大差异，说明有效成分的含量差别较大，质量不稳定。比较人工虫草与天然虫草指纹图谱发现，北虫草含有特征成分虫草素，而冬虫夏草和发酵虫草菌粉中虫草素的含量很低。

参考文献：

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（收稿日期：2015-03-08；编辑：陈静）