金华地区规模猪场猪链球菌2型的分离鉴定及特性研究

张超颖，蒋小武，沈红霞，杨云凯，章红兵，方维焕

(1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州310029;2.金华职业技术学院)

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是引起断奶仔猪死亡的重要原因之一，且可导致不同年龄段猪的多种疾病，如败血症、多发性关节炎、急性脑膜炎等［1］。该病原广泛分布于世界各地规模化养猪地区，根据其荚膜抗原的不同可分为35 种血清型(血清型1－ 34 和血清型1/2)，其中猪链球菌2 型(SS2)流行最为广泛，是一种重要的人畜共患病病原［2－3］。随着我国猪场规模化养殖程度的不断提高，作为规模猪场三大疫病之一的猪链球菌病已经引起人们的重视。

为了解金华地区规模猪场健康猪群携带猪链球菌的现状，本研究随机采集了4 个规模猪场不同年龄段临床健康猪的鼻拭子样品，进行猪链球菌的分离鉴定和生物学特性研究，旨在为该地区猪链球菌病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 SS2 参考强毒株HA9801，由南京农业大学陆承平教授馈赠。

1.2 试剂及器材 试验所用培养基;选择性THB培养基、鲜血琼脂平板培养基等购自青岛某生物有限公司。庆大霉素等34 种常用抗生素药敏试纸片，购自杭州某生物试剂有限公司;细菌微量生化反应管，购自杭州某微生物试剂有限公司，批号20131120;Taq DNA 聚合酶、DNA Marker 等购自大连某公司，PCR 引物合成于深圳某公司。试验器材主要包括PCR 仪(Bio-Rad)、凝胶成像仪、酶标仪(Thermo 公司)等。

1.3 试验动物 6 周龄雌性BALB/C 小鼠购自上海某公司。

1.4 样品采集 金华地区4 个规模猪场不同年龄、临床表现健康猪(分为哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和母猪)采集鼻拭子320份，用灭菌棉签伸入猪只鼻腔较深处刮取黏膜表面，立即投入装有5 mL THB液培养基的无菌具盖试管中，低温保存，2 h 内送回微生物实验室进行分离培养。

1.5 细菌分离培养及形态观察 将各猪场采集的样品于37℃增菌培养24h 后，无菌操作，用接种环挑取样品划线接种于鲜血琼脂平板，37℃培养24 h。挑取乳白色、半透明、直径1 ～2 mm 的圆形疑似菌落，镜检后接种于鲜血琼脂平板进行纯培养，观察细菌生长情况。挑取纯培养物进行革兰氏染色、镜检及其他生物学特性试验。

1.6 生化鉴定 挑取纯培养物按常规方法进行生化试验［4］，观察并记录结果。

1.7 血清型鉴定 参考文献合成引物GDH 与cps2J，进行双重PCR 扩增鉴定SS2［5］，其中GDH 大小为688 bp，cps2J 大小为457 bp。

1.8 致病力试验 分别将金华SS2 分离株与HA9801(阳性对照)于37℃振荡培养至OD600≈0.3－0.4，离心收集菌体，PBS 清洗，调整细菌浓度约为5 ×108CFU/mL(当量于HA9801 的LD50)，并进行10 倍连续稀释，平板计数以确定实际接种量［6］。腹腔注射于6 周龄雌性BALB/C 小鼠，1 mL/只，每组6 只，阴性对照组注射灭菌PBS。注射后各组分别饲养，给予充足饮水和饲料，定时观察记录小鼠的发病和死亡情况，连续观察7 d。

1.9 药敏试验 用K-B 纸片扩散法进行药敏试验［7］，用灭菌棉签将菌液均匀涂布于鲜血琼脂培养基表面，至菌液稍干后，将不同药敏试纸片贴于培养基的适当位置。37℃培养24 h，观察并测定抑菌圈大小，进行耐药性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌培养特性及形态特点 经测定，分离到的细菌在鲜血琼脂平板上生长良好，菌落呈圆形半透明、灰白色、似针尖大小，有溶血现象，多数为α 溶血，部分呈β 溶血。细菌纯培养物涂片、革兰氏染色后，在光学显微镜下可见革兰氏阳性、呈短链状的蓝紫色球菌，生化试验符合猪链球菌特性［4］。

2.2 血清型鉴定 分离SS 疑似菌株4 株，其中SS2 型菌2 株。4 株疑似猪链球菌菌株双重PCR 鉴定判定:GDH 阳性即为猪链球菌，GDH 与cps2J 双阳性则为猪链球菌2 型(图1)。

图1 4 株疑似猪链球菌菌株的PCR 鉴定

2.3 致病力测定 接种不同SS2 菌株后，观察1 周统计接种剂量及小鼠死亡数(详见表1与图2)。

表1 猪链球菌2 型分离株感染小鼠死亡率

图2 猪链球菌2 型分离株感染小鼠死亡曲线

由表2、图1可见，2 株分离菌SS2-324 与SS2-325 对小鼠具有一定致病力，但与参考强毒株HA9801 相比，致病力较弱，且小鼠死亡时间延后。

2.4 药敏试验结果 见表2。

表2 两株猪链球菌2 型分离株对不同抗菌素的敏感性测定(纸片法)

由表2可见，采用34 种不同类型的抗菌素进行药敏试验测定抑菌圈大小，判定不同菌株药物敏感程度，其中2 株猪链球菌2 型菌株对氯霉素、氧氟沙星等大部分药物敏感，对庆大霉素、卡那霉素等药物出现不同程度耐药，对四环素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和链霉素完全耐药。

3 小结与讨论

链球菌广泛分布于自然界，有多种血清型，主要存在于动物鼻咽部、皮肤、消化道粘膜，经消化道和呼吸道感染。

本研究旨在对金华地区规模化猪场猪链球菌病进行流行病学调查，通过对疑似发病猪进行临床诊断、病理剖检、病料采集及鼻拭子采样等手段进行猪链球菌病调查。

通过采集4 个规模猪场不同年龄段健康猪群的鼻拭子样品，虽在疑似临床病例的病料中未分离到猪链球菌，但在4 个猪场的鼻拭子样品中分离到了4 株猪链球菌，经PCR 方法进行血清型鉴定发现其中有2 株为猪链球菌2 型。且4 株病菌均来自同一猪场，表明该猪场可能存在猪链球菌2 型的隐性感染，一旦感染其他疫病，则可能出现临床症状。

通过对2 株猪链球菌2 型分离株的药敏试验结果显示，对临床常用的5 种抗菌药物(四环素、氨曲南、多粘菌素、阿米卡星和链霉素)已产生完全耐药，提示可能与养殖场长期使用该类抗菌药物等因素有关，应引起注意和重视。

［1］Wertheim HF，Nghia HD，Taylor W，＆ Schultsz C.Streptococcus suis:an emerging human pathogen［J］.Clinical infectious diseases:an official publication of the Infectious Diseases Society of America，2009，48(5):617－625.

［2］Feng Y，et al.Streptococcus suis infection:an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases［J］.Virulence，2014，5(4):477－497.

［3］Wei Z，et al.Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007［J］.Veterinary microbiology，2009，137 (1－ 2):196－201.

［4］陆承平，兽医微生物学(第四版)［M］.北京:中国农业出版社，2007.8.

［5］Tang Y，et al.Genetic and virulence characterization of Streptococcus suis type 2 isolates from swine in the provinces of Zhejiang and Henan，China［J］.Folia microbiologica，2011，56(6):541－548.

［6］Tao Chen QH，Zhaolong Li，Wei Zhang，Chengping Lu，Huochun Yao.Construction and Characterization of a Streptococcus suis Serotype 2 Recombinant Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein［J］.PloS one，2012，7(7):10.

［7］姚火春.兽医微生物学实验指导［M］.北京:中国农业出版社，2002.2.