绒毛组织中抑制素A表达与稽留流产的相关性研究*

王小敏，王小燕，杨联君，韩萍

(深圳市龙岗区第二人民医院妇科，深圳龙岗518112)

绒毛组织中抑制素A表达与稽留流产的相关性研究*

王小敏，王小燕，杨联君，韩萍

(深圳市龙岗区第二人民医院妇科，深圳龙岗518112)

目的研究抑制素A在早期正常妊娠、稽留流产患者绒毛中的定位及表达水平，探讨抑制素A与稽留流产的相关性。方法选取2012年8月至2013年10月期间自愿在我院妇科终止妊娠的80例患者，其中20例正常早孕要求人工流产者为对照组，稽留流产60例，后者根据胚胎停止发育至排出母体外的时间，分成A组(＜2周)，B组(2～4周)以及C组(＞4周)(n=20)。采用免疫组织化学技术和计算机图像分析系统，检测绒毛组织中抑制素A表达情况。结果抑制素A在对照组、稽留流产组绒毛的合体滋养细胞、细胞滋养细胞、毛细血管内皮细胞的胞浆呈不同程度的阳性染色。稽留流产组绒毛抑制素A的表达水平明显低于对照组(P＜0.05)，但A、B、C 3组间表达无统计学意义(P＞0.05)。结论绒毛组织中抑制素A对于正常早期妊娠的维持起重要作用，抑制素A表达水平降低可能在稽留流产发生过程中具有重要作用。

抑制素A;稽留流产;绒毛组织

抑制素A属于转化生长因子－β(transformation growth factor－β，TGF－β)的超家族成员，妊娠期主要来源于胎盘的分泌。近年来研究发现，抑制素A在母体正常表达对妊娠的维持和发展起重要作用［1］。本文通过研究稽留流产和正常早孕患者绒毛组织中抑制素A的表达，探讨其与稽留流产的相关性，为稽留流产病因的深入研究和临床防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象选取2012年8月至2013年10月期间自愿在深圳市龙岗区第二人民医院妇科终止妊娠的80例患者，其中20例自愿要求行人工流产的正常早孕患者为对照组，稽留流产患者60例为病例组，行清宫术，其诊断标准参照人民卫生出版社《妇产科学》第8版［2］。按照胚胎停止发育至排出母体外的时间，将观察组再分成A组(＜2周)，B组(2～4周)以及C组(＞4周)3组，每组20例。患者年龄20～40岁，孕次1～4次，产次0～3次，均为单胎，孕周6～12+6周，各组差异均无统计学意义(P＞0.05)。本次孕期无特殊用药史，无放射线及化学物质接触史，无生殖器畸形和感染性疾病，无妊娠并发症及合并症。

1.1.2 标本收集将绒毛置于生理盐水中漂洗2次后，置于中性甲醛固定液中固定24～48h，酒精梯度脱水，经二甲苯透明后，石蜡包埋，各制备4μm切片备用。

1.1.3 主要试剂一抗:兔抗人多克隆抗体(抑制素A)，二抗:生物素标记的羊抗兔IgG、辣根酶标记的链酶亲和素、DAB显色试剂盒，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法抑制素A蛋白的检测按相应操作步骤，参照说明书进行。试剂盒提供阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。实验步骤如下:60℃烤片2h;二甲苯脱蜡15min，3次;依次经过无水乙醇、95%、90%、80%、70%的乙醇，各5min，蒸馏水5min水化;PBS洗5min，3次;枸橼酸缓冲液(约92℃～95℃)煮沸抗原修复15min，自然凉至室温。PBS洗5min，3次;3%双氧水封闭20min，PBS洗5min，3次;正常山羊血清封闭，37℃20min;一抗孵育，4℃过夜;复温20min，PBS洗5min，3次;二抗孵育37℃20min，PBS洗5min， 3次;三抗孵育37℃20min;PBS洗5min，3次; DAB显色，镜下观察结果，适时终止;苏木素复染5min，自来水冲洗片刻，1%的盐酸酒精(75%)溶液分化30s，自来水冲洗5min蓝化;依次经过70%、80%、90%、95%、无水乙醇脱水，各5min，二甲苯15min，3次;封片，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.2 结果判定以滋养细胞胞浆出现棕黄色颗粒，染色明显高于背景为阳性，采用图像分析软件Olympus CellSens Dimension对其进行定量分析，每张切片放大200倍后随机取10个不重叠的视野，以平均光密度(optical density，OD)代表抑制素A着色强度。

1.3 统计学处理计量资料均以¯x±s的形式表示，用SPSS 17.0对数据进行统计学处理，组间差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学显著意义。

2 结果

2.1 抑制素A在各组绒毛中的表达定位免疫组化结果显示，在阴性对照片中，绒毛滋养细胞胞浆中未见棕黄色颗粒，无阳性染色，见图1A。对照组绒毛的合体滋养细胞、细胞滋养细胞、毛细血管内皮细胞的胞浆均呈阳性染色，位于绒毛最外层的合体滋养细胞和其内层的细胞滋养细胞阳性染色最强，血管内皮细胞次之，绒毛间质无阳性染色，见图1B。抑制素A在稽留流产组绒毛中的表达定位与对照组相一致，但染色程度明显低于对照组，以A组为代表，见图1C。

图1 免疫组化法检测抑制素A在绒毛中的表达

2.2 抑制素A在各组绒毛中的表达水平定量分析表明，与对照组相比，抑制素A在稽留流产组的表达水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。稽留流产组按照胚胎停止发育至排出母体外的时间长短不同分成3组，A、B、C 3组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 抑制素A在各组绒毛中的表达(OD值，¯x±s)

3 讨论

抑制素与女性生殖内分泌关系密切，其中抑制素A是整个妊娠过程中抑制素的主要存在形式，在妊娠期的内分泌调节中发挥了更重要的作用［3］。妊娠早期，抑制素A在子宫内膜蜕膜化、免疫耐受、种植准备、胚胎及滋养细胞的种植和分化中起重要调节作用，调控滋养层细胞侵入子宫蜕膜，使子宫内膜形成胎盘的母体部分［4，5］。抑制素A的水平是维持正常早期妊娠的必要条件［5，6］。国内外研究认为，胎盘组织分泌的抑制素A既可以分泌入母体血液循环，也可以分泌入胎儿血液循环，起到调节妊娠期母体促性腺激素释放、雌孕激素的分泌和胎儿的生长发育的作用;同时又能够以旁分泌或自分泌方式参与胎盘局部调节轴中促性腺激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、雌孕激素等各种激素之间的生殖内分泌调节，从而影响着妊娠的发生、发展及胎儿的生长发育［7］。

稽留流产是自然流产的一种特殊类型，一直来也是优生优育领域重要的研究课题。林春丽等［8，9］研究发现稽留流产组血清抑制素A水平低于正常妊娠组，提示抑制素A对稽留流产的诊断和预测具有一定价值，但对于其在胎盘绒毛组织中的表达研究不多。通过研究，我们发现抑制素A在稽留流产和对照组绒毛的合体滋养细胞、细胞滋养细胞、毛细血管内皮细胞的胞浆均呈阳性染色，位于绒毛最外层的合体滋养细胞和其内层的细胞滋养细胞阳性染色最强，血管内皮细胞次之，绒毛间质无阳性染色，与张钰等［3］的研究结果一致。但Kondi［10］等发现早孕期抑制素A表达在合体滋养细胞和中间滋养细胞及细胞滋养细胞却不表达，分析原因可能与不同研究所采用抑制素A抗体所针对抗原决定簇的特异性不同有关。

此外，我们研究发现抑制素A在稽留流产及正常早期妊娠绒毛中均有一定程度表达，稽留流产中的表达明显低于正常早孕组，差异有统计学意义(P＜0.05)，但胚胎停止发育后滞留母体内的时间长短对抑制素A表达水平无明显影响(P＞0. 05)，可能与其半衰期短(45min)有关系，说明抑制素A水平下降与稽留流产的发生密切相关，同时也提示抑制素A可作为一个早期发现稽留流产的临床生化指标，为稽留流产的早期诊断提供了新思路。

我们推测，由于胎盘绒毛合成抑制素A能力降低，一方面可能引起妊娠期母体激素分泌、物质代谢紊乱，另一方面还可能引起胎盘局部激素、细胞因子等内环境发生变化，使胎盘局部调节轴中人绒毛膜促性腺激素、雌孕激素等各种激素合成释放紊乱，导致滋养细胞的侵蚀能力降低，胎盘浅着床，同时还影响滋养层细胞的分化、胚泡植入，影响胚胎的生长发育，最终导致胚胎停止发育，发生稽留流产。

综上所述，抑制素A水平下降与稽留流产的发生密切相关，为临床早期诊断和防治稽留流产的发生提供了理论依据和新思路，然而抑制素A对生殖过程的精细调节有待进一步研究。

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Expression of Inhibin A in the Villi of Missed Abortion

WANG Xiao－min，WANG Xiao－yan，YANG Lian－jun，et al
(Department of Gynecology，The Second People＇s Hospital of Longgang District，Shenzhen Guangzhou 518112，China)

ObjectiveTo study the expression of inhibin A in the villi of patients with normal early pregnancy and missed abortion，and the correlation between inhibin A and missed abortion.Methods80 patients registered to the Department of Gynecology in our hospital between August 2012 and October 2013 were collected.20 cases of normal early pregnancy with artificial abortion were served as control group.60 cases of missed abortion were divided into three groups according to the time between embryo death and removal from pregnant women:Group A(≤2weeks)，Group B(2～4weeks)and Group C(≥4weeks)(n=20).The expression of inhibin A was determined by immunohistochemistry technology and computer image analysis systems.ResultsInhibin A exhibited positive staining at the cytoplasm of syncytiotrophoblast，cytotrophoblast and capillary endothelial cell of villi.The expression of inhibin A in the villi of the missed abortion group was less than that in the control group(P＜0.05).There were no significant differences of inhibin A expression in villi among groupA，B and C(P＞0.05).ConclusionInhibin A from villi plays an important role in sustaining normal early pregnancy. The low expression of inhibin A may play an important role in the process of missed abortion.

Inhibin A;Missed abortion;Villi

R714.2

A

2095－4646(2015)01－0016－03

2014－12－01)

深圳市龙岗区科技创新局资助项目(YS2011073)