RANKL/RANK/OPG系统与绝经后骨质疏松模型的研究

2015-05-24卢建华

浙江中西医结合杂志 2015年9期

任洁卢建华

任洁卢建华

RANKL/RANK/OPG；绝经后骨质疏松；护骨素；MiR-503；肿瘤坏死因子-a

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指绝经后的妇女由于卵巢功能减退，雌激素不分泌或者分泌过少，骨吸收大于骨形成，形成高转化型的骨质疏松特点。临床研究[1-2]发现：＞60岁的女性发病率高达24%，中老年女性诊断为骨质疏松是男性的3倍。绝经后骨质疏松模型是通过切除动物的卵巢，造成雌激素分泌减少，来模拟PMOP。雌激素的减少破坏了骨吸收和骨形成的平衡，而RANKL/RANK/OPG系统存在于骨吸收过程中，必然受到雌激素的影响。因此，本文主要针对RANKL/ RANK/OPG系统与绝经后骨质疏松动物模型的成果进行研究，现综述如下。

1 RANKL/RANK/OPG系统

细胞核因子kB受体活化因子配体（the nucleus factor kB receptor activation factor ligands，RANKL），即破骨细胞分化因子，属于TNF家族，发现于成骨细胞表面，为Ⅱ型跨膜蛋白。核因子kB受体活化因子（nuclear factor kB receptor activation factor，RANK）为Ⅰ型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，存在于破骨细胞及其祖细胞表面，是RANKL的唯一靶信号受体。护骨素（osteoprotegerin，OPG）又称骨保护蛋白，是一种可溶性的分泌型糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，由成骨细胞合成和分泌。RANK信号转导的主要3个单独途径[3-5]包括：①蛋白酶c-允un氨基末端激酶（c-允un N-terminal kinase，允NK）途径，调节c-fos和c-jun（c-fos和c-jun是转录调节因子，属亮氨酸拉链家族成员）；②核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）途径，调节破骨细胞生成和蛋白酶的产生；③丝氨酸/苏氨酸激酶Akt（又称蛋白激酶B，protein kinase B，PKB）途径，抑制凋亡，调节细胞骨架重排，可能与NF-kB途径有交叉。

RANKL/RANK/OPG系统作用于骨重建的骨吸收过程中。在骨吸收过程中，许多上游的细胞因子（如雌激素、糖皮质激素、肿瘤坏死因子等）会影响成骨细胞分泌RANKL和OPG；此外存在于破骨细胞循环祖细胞—CD14+外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）上的小核糖核酸-503（mini ribonucleic acid-503，miR-503）能调控RANK表达[6]。当RANKL作用于破骨细胞前体上的受体RANK时，触发破骨细胞的成熟，并阻止破骨细胞的凋亡延长其寿命，从而诱导骨吸收。而OPG通过竞争性结合RANKL，从而减少RANKL与RANK结合，抑制破骨细胞的分化成熟、诱导破骨细胞凋亡。当局部微环境中的RANKL/OPG浓度比升高时，破骨细胞的活跃度增加，引起骨密度的下降，造成骨质疏松。

2 绝经后骨质疏松模型

目前用于研究骨质疏松症的模型有许多种类，主要包括绝经后、老年型、激素型、废用型以及其它药物诱导的模型。其中绝经后的模型通过切除动物的卵巢（ovariectomized，OVX），从而引起雌激素的减少，来模拟绝经后骨质疏松症。对于动物的选择，主要包括啮齿动物、兔、羊、非人类灵长类动物等。1969年由Svallie首次建立了大鼠绝经后骨质疏松动物模型。雌性大鼠在行卵巢切除术后，骨吸收大于骨形成，松质骨的骨转化加快、骨量减少、骨强度下降，这种骨代谢的变化与早期绝经后妇女相类似。杨林等[7]研究去势大耳兔脊柱骨发现：去势后3个月兔腰椎骨开始呈现骨质疏松表现，术后4个月可形成可靠的骨质疏松模型。Liu等[8]采用OVX绵羊，并从切除卵巢后第四周开始按0.45mg/kg进行肌注甲强龙，持续10个月，并在最后4周逐渐减少甲强龙的注射量，在卵巢切除12个月后腰椎BMD下降超过25%，成功构建了骨质疏松羊模型。1986年首次报道了使用非人类灵长类动物构建骨质疏松模型，灵长类动物在行OVX术9个月后进行药物干预治疗，治疗应至少持续16个月[9]。OVX骨质疏松模型主要是由于雌激素减少，影响骨吸收和骨形成的平衡，造成骨量减少、骨微结构破坏，引起绝经后骨质疏松症。但是，目前用于RANKL/RANK/OPG系统方面研究的OVX骨质疏松模型主要集中在鼠类模型上[10-13]。

3 绝经后骨质疏松模型与RANKL/RANK/OPG系统

绝经后的骨质疏松模型通过将动物的卵巢切除，造成雌激素分泌减少，引起骨吸收大于骨形成，从而构建高转化型的骨质疏松模型。而RANKL/ RANK/OPG系统是骨吸收过程中一条重要的途径，因此雌激素减少引起的骨质疏松必然与之有一定的联系。雌激素影响骨重塑主要通过2条途径：一方面，雌激素通过与破骨细胞和成骨细胞上的雌激素受体（estrogen receptor，ER）结合，直接调节骨代谢[14-15]；另一方面，雌激素通过与ER结合，调节各种细胞因子的分泌，如：OPG、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、白细胞介素-1（interleukins-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukins-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）。其中OPG和TNF-α参与RANKL/RANK/OPG系统，影响RANKL的表达。当雌激素减少时，OPG分泌减少，RANKL/ OPG浓度比升高，RANKL与RANK结合增加，促进破骨细胞的分化成熟，骨吸收大于骨形成，引起骨质疏松。而此时TNF-α表达增加，TNF-α通过前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）诱导RANKL的表达并降低OPG的表达，从而促进破骨细胞生成、分化和成熟。此外，雌激素减少后，小核糖核酸miR-503在PBMCs上明显减少，RANK表达增加，骨吸收活跃，引起骨质疏松。以下是对绝经后骨质疏松模型与RANKL/RANK/OPG系统在OPG、TNF-α及miR-503方面的相关的研究进展。

3.1 OPG OPG对破骨细胞的形成具有决定性作用，可以作为骨量调节过程中的一个可溶性因子，并可用来治疗破骨细胞增加相关的骨质疏松症[16]。而雌激素可以通过ER-α而不是ER-β影响成骨细胞产生OPG[17]。在相关实验研究[18]方面，OVX组的大鼠与正常组相比，雌激素水平降低，OPG的基因表达减少，而RANKL基因表达增加，M-CSF无显著差异，大鼠的中轴骨和四肢骨上的破骨细胞数增加以及骨密度下降。那么是否可以通过干预来促进OPG的分泌，使RANKL/OPG浓度比降低，从而抑制雌激素减少引起的骨吸收。王强等[19]通过跑台运动来治疗去卵巢大鼠骨质疏松，结果发现，和去卵巢组比较,跑台运动组的OPG的mRNA表达升高，差异有统计学意义；认为力学刺激能通过促进去卵巢大鼠骨组织中OPG的表达而发挥其抗绝经后骨质疏松的效果。Spilmont等[20]在研究石榴籽油（pomegranate seed oil，PSO）对OVX小鼠防止骨质流失中发现含PSO血清直接或间接地增加成骨细胞分化和抑制破骨细胞形成，其中OPG转录水平显著升高（达到治疗前的4.4倍），RANK的表达显著下调（0.51倍，P＜0.05）。Ma等[21]通过果糖二磷酸锶盐治疗OVX大鼠，结果显示，骨密度、骨微结构及骨强度显著改善，血清中的RANKL水平下降、OPG水平增加，骨髓中的RANKL基因表达减少、OPG基因表达增加。

但是也有报道[22-23]，随雌激素水平降低，骨组织OPG的表达却升高。推测可能雌激素水平突然降低，机体启动应激保护机制，骨吸收和骨形成相互偶联，骨重建代偿性增加，从而引起OPG表达升高。

3.2 TNF-α 雌激素缺乏引起的骨质流失中最重要的细胞因子是骨髓T淋巴细胞产生的TNF-α[24]。雌激素通过影响TNF-α和IL-1，进而影响成骨细胞表达RANKL，TNF-α抑制剂能显著减少雌激素缺乏引起骨吸收增加的影响[25-26]。Roggia等[27]研究发现，①来自于切除卵巢小鼠的T细胞培养产生TNF的数量增加，引起RANKL的表达增加，进而导致破骨细胞形成；②卵巢切除术在野生型（wild type，WT）小鼠能快速诱导骨质流失，而在TNF-/-小鼠上不行；③卵巢切除术引起的骨质流失，在T细胞缺陷的小鼠上没有发挥作用，当从WT小鼠移植T细胞则恢复骨质流失，但是从TNF-/-小鼠上移植T细胞则不行。这些结果表明雌激素缺乏引起骨质疏松的主要机制是通过增加骨髓T细胞数量，进而增加TNF的表达，引起RANKL的表达增加，促进破骨细胞形成。那么是否可以通过增加雌激素来抑制TNF-α的表达？在实验研究方面，段永宏等[28]用选择性雌激素受体调节剂-雷诺昔芬治疗去势后大鼠，结果表明经雷诺昔芬治疗后的OVX小鼠骨小梁周围及髓腔内TNF-α阳性表达明显减弱，接近假手术组水平；这表明雷诺昔芬起到了类似雌激素的保护作用，抑制了由TNF-α诱导而产生的骨吸收，减弱了因雌激素缺乏引起的骨质疏松症。在临床研究方面，刘景科等[29]通过青娥方治疗绝经后骨质疏松伴有骨痛患者，通过测定治疗前后血清中的TNF-α，发现TNF-α水平降低，可抑制绝经后代谢性骨丢失，促进骨形成。

3.3 MIR-503 目前，对于小分子核糖核酸在破骨细胞形成和骨吸收方面的研究较少，而miR-503通过RANK调控破骨细胞形成。在OVX小鼠上，使用miR-503拮抗剂，抑制其表达，引起RANK蛋白表达增加，促进骨吸收、骨量减少；当使用miR-503激动剂时，miR-503超表达，抑制骨吸收和骨量减少[6]。

4 展望

以上研究表明，绝经后骨质疏松动物模型通过卵巢切除，引起雌激素的缺乏，导致OPG、MIR-503表达降低和TNF-α表达增加，进而影响RANKL/ RANK/OPG信号通路，最终促进破骨细胞活化、分化、成熟以及阻止破骨细胞凋亡，快速诱导骨质流失。目前用于RANKL/RANK/OPG系统方面研究的OVX骨质疏松模型主要集中在鼠类模型上。雌性鼠在行卵巢切除术后，骨代谢的变化与早期绝经后妇女相类似：骨吸收大于骨形成，松质骨的骨转化加快、骨量减少、骨强度下降。因此，OVX骨质疏松动物模型对于绝经后骨质疏松症模拟是可行的，并在RANKL/RANK/OPG信号通路上的研究也有一定进展。但是雌激素的缺乏并不是仅仅通过RANKL/ RANK/OPG这一条通路引起骨质流失，还可以通过雌激素受体等其它生物因子影响骨重塑，因此还有待进一步研究。此外，基于OVX骨质疏松模型的RANKL/RANK/OPG系统方面研究在其他动物模型上有待进一步开发。

［1］Li W，Liu C，Wang H.Screening for specific biomarkers in the serum of postmenopausal osteoporosis patients using proteomic fingerprint techniques［J］.Biomed Rep，2013，1（1）：129-133.

［2］Wilhelm M，Roskovensky G，Emery K，et al.Effect of resistance exercises on function in older adults with osteoporosis or osteopenia：a systematic review［J］.Physiother Can，2012，64（4）：386-394.

［3］Yu M，Chen X，Lv C，et al.Curcumol suppresses RANKL-induced osteoclast formation by attenuating the允NK signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，447（2）：364-370.

［4］Liu W，Wang S，Wei S，et al.Receptor activator of NF-kappaB（RANK）cytoplasmic motif，369PFQEP373，plays a predominant role in osteoclast survival in part by activating Akt/PKB and its downstream effector AFX/FOXO4［J］.允Biol Chem，2005，280（52）：43064-43072.

［5］Moriwaki S，Suzuki K，Muramatsu M，et al.Delphinidin,one of the major anthocyanidins,prevents bone loss through the inhibition of excessive osteoclastogenesis in osteoporosis model mice［J］.PLoS One，2014，9（5）：e97177.

［6］Chen C，Cheng P，Xie H，et al.MiR-503 regulates osteoclastogenesis via targeting RANK［J］.允Bone Miner Res，2014，29（2）：338-347.

［7］杨林，刘建民，赵爱莲，等.去势大耳兔脊柱骨的CT形态及QCT骨密度测定分析［J］.中国骨质疏松杂志，2012，18（1）：21-23.

［8］Liu D，Zhang Y，Zhang B，et al.Comparison of expansive pedicle screw and polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw in osteoporotic sheep lumbar vertebrae∶biomechanical and interfacial evaluations［J］.PLoS One，2013，8（9）：e74827.

［9］Smith SY，Jolette J，Turner CH.Skeletal health:primate model of postmenopausal osteoporosis［J］.Am允Primatol，2009，71（9）：752-765.

［10］Lee EJ，Kim JL，Kim YH，et al.Phloretin promotes osteo