黄芪多糖对Caco-2细胞P-gp功能、表达的影响

陈琳瑶 阮 丹 王跃鑫 黄巧玲

黄芪多糖对Caco-2细胞P-gp功能、表达的影响

陈琳瑶 阮 丹 王跃鑫 黄巧玲

目的 观察黄芪多糖（APS）对Caco-2细胞P糖蛋白（P-gp）功能、表达的影响。方法 采用MTT法考察药物对细胞的毒性,确定药物最大无毒浓度；流式细胞仪测定Caco-2细胞P-gp底物罗丹明-123（Rh-123）和抗体的荧光强度，评价APS对P-gp功能和表达的影响；建立Caco-2细胞单层模型，观察APS对Rh-123跨膜转运的影响。结果 细胞毒性实验结果显示，APS在0.1～100μg/mL浓度范围内对Caco-2细胞无明显毒性，细胞存活率＞90%；不同浓度的APS作用后，增加细胞内Rh-123的蓄积，对P-gp功能表现为抑制作用；中、高浓度50、100μg/mL的APS对P-gp表达有抑制作用［（26.72±2.43）、（23.97±2.08）比（30.10±1.28），P＜0.05］，其表达量分别降低11.23%和16.41%；高浓度APS 100μg/mL明显抑制Rh-123的双向跨膜转运，对P-gp有抑制作用。结论黄芪多糖（APS）对P-gp的功能和表达有一定的抑制作用，且在高浓度尤为明显，能显著增加Rh-123在Caco-2细胞内的蓄积，并抑制其双向跨膜转运。

黄芪多糖；P糖蛋白；Caco-2细胞

中药辅助治疗肿瘤具有毒性小、安全有效、多靶点等优势，其在逆转肿瘤多药耐药（multidrug resistance，MDR）[1-3]研究中受到越来越广泛的关注。肿瘤多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构不同作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药现象，其中P糖蛋白（P-gp）介导的多药耐药现象引起了广泛的关注[4]。P-gp是一种能量依赖性膜蛋白，最初发现于肿瘤细胞，能将药物逆浓度梯度转运至胞外。在肿瘤治疗中，P-gp能将化疗药物排出胞外，降低胞内药物浓度，从而对治疗造成不利影响。我院的复方氨肽口服液中主要中药组分为黄芪提取液，主要有效成分为黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），临床上广泛用于调节免疫功能。临床试验表明，复方氨肽口服液可通过体内免疫增强起到辅助抗癌作用[5-6]，然而该药是否对P-gp存在抑制作用从而逆转MDR现象则尚不明了。本实验采用人结肠癌细胞细胞Caco-2细胞为模型，研究复方氨肽口服液主要成分黄芪多糖对Caco-2细胞P糖蛋白功能、表达的影响，为复方氨肽口服液在临床上的合理应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 药物及试剂 Caco-2细胞（上海细胞库），0.25%胰蛋白酶、DMEM培养基、0.01mol/L磷酸盐缓冲盐（PBS）（GIBCO，USA），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物材料有限公司），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，USA），100U/mL青-链霉素双抗（碧云天生物技术研究所），黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），购自陕西昂盛生物医药科技有限公司，纯度：70%，盐酸维拉帕米（Ver）（中国食品药品检定研究院，批号100223-200102），环孢素A（CsA）（Sigma，USA），罗丹明-123（Rh-123）（Sigma，USA）。

1.2 仪 器 恒温CO2孵箱（Forma SeriesⅡ Water允acketed，HEPA filter，Thermo，美国），生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），倒置相差显微镜（Nikon，TS100，日本）酶联免疫检测仪（Wellscan MK2，Thermo，美国），流式细胞仪（Becton-Dickinson FACScalibur，美国BD公司），12孔Transwell细胞培养板（Corning Costar，美国）。

2 实验方法

2.1 Caco-2细胞培养及细胞毒性实验 将对数生长期的Caco-2和ECV304细胞接种于25cm2的培养瓶中，加入5mL含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基。在37℃、5%（体积分数）CO2的恒温培养箱内进行培养，隔日换液。待细胞长至70%～90%时用0.25%胰酶消化并传代。

将处于对数生长期的细胞以2×104个/mL的密度接种于96孔培养板，每孔200μL，上述条件培养24h，小心吸尽每孔培养液。设置空白调零孔、阴性对照孔及实验孔，其中空白孔不接种细胞。空白调零孔和阴性对照孔每孔加入不含药物的全培养基200μL，实验孔中加入不同浓度的APS（0.1、10、20、50、100、200μg/mL）的系列工作液200μL，平行操作4份，按上述条件培养72h。每孔加入MTT液（5mg/ mL）20μL，37℃孵育4h。终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150μL DMSO，振荡摇匀使结晶物溶解，酶标仪进行检测，以空白对照调零后，用酶联免疫检测仪测定490nm处的光密度值（OD），与阴性对照组比较计算细胞存活率，选择存活率＞90%的最大药物浓度。

细胞存活率100%=（实验组平均OD值/阴性对照组平均OD值）×100%

2.2 黄芪多糖对Rh-123摄取的影响 精密称取Rh-123，用去离子水溶解并稀释，配成一定浓度的Rh-123溶液。将处于对数生长期的 Caco-2和ECV304细胞用胰酶消化，制成单个细胞，离心（1500r/min，5min），弃去上清液，PBS分散成细胞数为1×106的细胞悬液，均匀接种于EP管中。离心后弃上清液，按照实验分组分别加入PBS配制的Ver阳性对照溶液（50μmol/L），APS系列工作液（0.1、10、20、50、100μg/mL）或PBS，于37℃、5%CO2培养60min，置冰上终止作用，4℃离心（2500r/min，15min），弃去上清液，冰冷的PBS洗2次。按实验分组分别加入Rh-123溶液或PBS，37℃、5%CO2培养60min，置冰上终止作用，4℃离心弃去上清液，冰冷的PBS洗2次，4℃离心弃去上清液，细胞重悬于0.5mL PBS液中，用流式细胞仪测定10 000个细胞内荧光强度。2.3 黄芪多糖对P-gp表达的影响 用0.25%胰酶将处于对数生长期的Caco-2细胞消化分散成单细胞悬液，接种于25cm2培养瓶，加入含10%FBS、100U/mL青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基。在37℃、5%CO2恒温培养箱内进行培养，细胞贴壁后，按照实验分组分别加入黄芪多糖系列工作液（实验组，20、50、100μg/mL），环孢素溶液（阳性对照组，5μmol/L）或含10%FBS的DMEM培养基（阴性对照组）共培养72h。胰酶消化每瓶分装至3个2mL的EP管，PBS洗2次，离心，弃上清液。按照实验分组，加入PBS或抗体，4℃，孵育12h。孵育完毕后用PBS洗2次，离心，弃上清液，最后用0.5mLPBS重悬。激发波长为466nm，发射波长为535nm，测定10000个细胞，收集535nm处的荧光进行分析。

2.4 黄芪多糖对Rh-123跨膜转运的影响 将密度为1×105个/mL的Caco-2单细胞悬液接种至12孔Transwell板，第一周隔日换液，后2周每日换液，待跨膜电阻值稳定在350Ω/cm2时用于转运实验。实验分组见表1。

2.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行数据统计分析，计量资料以均值±标准差（±s） ，组间比较用方差分析或t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 黄芪多糖对Rh-123跨膜转运影响实验分组

3 结果

3.1 细胞增殖实验 细胞毒性实验结果显示，APS在0.1～100μg/mL浓度范围内对Caco-2细胞无明显毒性，培养72h后细胞存活率＞90%，见表2。故选取此浓度范围进行下一步的实验研究。选取维拉帕米浓度50μmol/L为实验浓度。由Caco-2细胞确定的非细胞毒性药物浓度在阴性对照ECV304细胞上也没有产生细胞毒性。

表2 不同药物浓度下Caco-2细胞和ECV304细胞存活率（±s）

表2 不同药物浓度下Caco-2细胞和ECV304细胞存活率（±s）

注：Ver：盐酸维拉帕米；CsA：环孢素A；APS：黄芪多糖

孔数 细胞存活率（%）药物APS（μg/mL）Ver（μmol/L）CsA（μmol/L）555555555浓度0.1 1 10 20 50 100 200 50 5 Caco-2 97.21±4.27 95.42±1.89 94.15±2.61 93.93±3.08 93.87±5.19 93.42±3.14 80.10±3.16 92.67±3.23 94.59±2.37 ECV304 97.52±3.12 95.17±4.89 96.23±2.83 95.31±3.01 94.78±2.90 91.97±3.43 83.76±2.77 95.99±2.95 94.26±2.41

3.2 黄芪多糖对Rh-123摄取的影响 实验结果表明，药物作用于Caco-2细胞后，APS各浓度组及阳性对照Ver组的荧光强度较空白对照组均有所增强，见表3。阳性对照组细胞内Rh-123的荧光强度显著高于空白对照组（P＜0.05），增加了42.19%，与文献报道相符，说明维拉帕米对Rh-123的外排有明显抑制作用；不同浓度的APS对Rh-123外排的抑制率随浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性，该结果表明APS对P-gp的功能有一定的抑制作用。

表3 黄芪多糖对Caco-2细胞中Rh-123外排的影响（±s）

表3 黄芪多糖对Caco-2细胞中Rh-123外排的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；Ver：盐酸维拉帕米；APS：黄芪多糖

组别空白对照组APS（μg/mL）孔数Ver（μmol/L）44444444浓度PBS 0.1 1 10 20 50 100 50细胞内荧光强度118.33±5.45 120.14±3.16 121.36±2.19 127.33±2.01* 138.66±4.15* 145.75±3.75* 159.00±6.40* 168.25±2.33*荧光强度增加百分数（%）0 1.53 2.56 7.33* 17.18* 23.17* 34.37* 42.19*

3.3 黄芪多糖对P-gp表达的影响 研究结果表明，与Caco-2细胞共培养72h后，阳性对照组（CsA组）细胞内荧光强度显著高于阴性对照组，说明环孢素可以明显诱导上调Caco-2细胞P-gp表达水平，与文献报道相符。HPS低浓度组（20μg/mL）细胞内的荧光强度与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），然而，中、高浓度组（50、100μg/mL）细胞内的荧光强度明显低于阴性对照组（P＜0.05），其表达量分别降低11.23%和16.41%。以上结果表明低浓度的APS对P-gp表达基本没有影响，随着浓度的增加，对P-gp的表达有抑制作用，使其表达量减少，见表4。

表4 不同浓度黄芪多糖对Caco-2细胞P-gp表达的影响（±s）

表4 不同浓度黄芪多糖对Caco-2细胞P-gp表达的影响（±s）

注：与阴性对照组比较，*P＜0.05；CsA：环孢素A；APS：黄芪多糖

组别阴性对照组APS（μg/mL）孔数P-gp表达增加量（%）--CsA（μmol/L）44444浓度-20 50 100 5细胞内荧光强度30.10±1.28 29.25±3.01 26.72±2.43* 23.97±2.08* 79.85±5.15* -11.23* -16.41* 165.28*

3.4 黄芪多糖对Rh-123转运的影响 在药物干预3h后，Rh-123外排率有显著变化。阳性对照维拉帕米组外排率为2.2%，较阴性对照组降低43.6%，表明其显著抑制了Rh-123的跨膜转运。APS高浓度组（100μg/mL）对Rh-123的外排率也有一定的抑制作用（P＜0.05），外排率为3.3%，较阴性对照组降低了15.4%；中、低浓度（20、50μg/mL）的APS则对Rh-123的外排转运抑制作用不明显（P＞0.05），见表5。

表5 黄芪多糖干预180min后Rh-123双向表观通透系数Papp和外排率

4 讨论

黄芪属补益类中药，可提高机体免疫力，其主要生物活性成分黄芪多糖（APS）药理作用广泛，具有增强机体免疫功能、强心、抗病毒、抗肿瘤等作用。APS辅助抗癌作用已有较多报道[7-8]，认为APS通过免疫调节来发挥抗癌作用，而至于是否涉及对多药耐药（MDR）存在逆转作用，则尚未完全明了。本研究发现，10～100μg/mL浓度范围的APS能够在1h内增加Caco-2细胞内的Rh-123的含量，抑制P-gp的功能，且呈现浓度依赖性。中、高浓度APS（50、100μg/ mL）不仅能抑制Rh-123的双向跨膜转运，长期使用还可抑制P-gp的表达。

上述结果表明，APS对Caco-2细胞P-gp功能和表达有抑制作用，属于P-gp抑制剂，但抑制作用弱于维拉帕米。推测APS在与抗肿瘤药物合用时，可抑制P-gp，增加细胞内化疗药物的浓度，从而逆转多药耐药，提高疗效。我院自制制剂复方氨肽口服液的主要中药组分为黄芪提取液，其有效成分为黄芪多糖。本次研究及有关临床研究[5]显示，复方氨肽口服液可以在肿瘤患者的临床治疗中做进一步的推广使用。

肿瘤多药耐药是造成肿瘤药物治疗失败的重要原因之一，造成多药耐药的机制十分复杂，而其中对P-gp所介导的多药耐药研究也有着广泛的研究。有研究表明，中药辅助治疗可通过竞争P-gp的结合位点、通过影响细胞膜的功能及通过影响ATP等方式，从而达到抑制P-gp的功能[9-12]。至于APS是通过哪种方式抑制P-gp的功能，有待进一步研究。

［1］楼江，李焕德.中药逆转肿瘤多药耐药作用机制研究进展［允］.中南药学，2011，9（10）：772-774.

［2］成日华，吴芬，李焕德.枸杞多糖对Caco-2细胞P-糖蛋白作用的影响［J］.中南药学，2012，10（7）：500-504.

［3］吴芬，成日华，李焕德.灵芝多糖肽对Caco-2细胞上P糖蛋白功能、表达的影响［J］.中南药学，2012，10（5）：334-338.

［4］Kelloff G允.Perspectives on cancer chemoprevention research and drug development［J］.Adv Cancer Res，2000，78：199-334.

［5］蒋沈君，刘云霞，匡唐洪.复方氨肽口服液对骨肉瘤化疗患者免疫功能的影响［J］.中国中医药科技，2011，18（6）：516-517.

［6］黄巧玲，王玖君，许爱娥.复方氨肽口服液的制备及免疫调节作用研究［J］.中国现代应用药学杂志，2000，17（3）：217.

［7］Dizdarevic S，Peters AM：Imaging of multidrug resisitance in cancer［J］.Cancer Imaging，2011，11：1-8.

［8］Liu X，Yang Y，Zhang X，et al.Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract inhibits cell invasion by modulating transforming growth factor-beta/Smad in HepG2 cell［允］.允Gastroenterol Hepatol，2010，25（2）：420-426.

［9］朴丽花，韩春姬，金元哲，等.人参皂苷Rh 2对耐药乳腺癌细胞P-糖蛋白和基质金属蛋白酶及其诱导物表达的影响［允］.临床与实验病理学杂志，2010，26（4）：471-476.

［10］Hennessy M，Spiers允P.A primer on the mechanics of P-glycoprotein the multidrug transporter［J］.Pharmacol Res，2007，55（1）：1-15.

［11］李峥，庄笑梅，李素云，等.P-糖蛋白中药抑制剂的研究进展［J］.解放军药学学报，2009，25（4）：326-329.

［12］Constantinides PP，Wasan KM.Lipid formulation strategies for enhancing intestinao transport and abosorption of P-glycoprotein（P-gp）substrate drugs：in vitro/in vivo case studies［J］.允Pharm Sci，2007，96（2）：235-248.

（收稿：2015-03-20 修回：2015-05-11）

Effect of Astragalus Polysaccharide on the Function and Expression of P-glycoprotein in Caco-2 cells

CHEN Linyao,RUAN Dan,WANG Yuexin,HUANG Qiaoling. Pharmacy,Third People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou(310009),China

Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharide（APS）on the function and expression of p-glycoprotein（P-gp）in Caco-2 cells.Methods The cytotoxicity of different drug concentrations was measured by MTT assay,in order to confirm the maximum non-toxic concentration of the drug.Flow cytometry was used to detect the fluorescence of rhodamine 123 concentration and antibody concentration to evaluate the effect of APS on the function and expression of P-gp.The Caco-2 cell monolayer was built to evaluate the effect of APS on the bi-directional transports of Rh-123.Results The cell viability of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration of APS was between 0.1 and 100μg/mL with MTT.Compared with control groups,APS increased the cellular Rh-123 concentration,showing an inhibitory effect on P-gp function.When the cells treated with APS at 50 and 100μg/mL concentrations,respectively,the expression levels of P-gp in Caco-2 cells were decreased by 11.23%and 16.41%to 26.72±2.43 and 23.97±2.08 compared to that in control group（30.10±1.28,P＜0.05）.Rh-123 bi-directional transport experiment showed that the p-gp level was obviously inhibited after 72 h incubation with 100 μg/mL concentration APS.Conclusion APS can inhibit the function and expression of P-gp in Caco-2 cells,and can also reduce the bi-directional transport of Rh-123 when it is at a high concentration.

astragalus polysaccharide;p-glycoprotein;Caco-2 cells

浙江省中西医结合学会科研项目（No.2013LYZD016）

杭州市第三人民医院药剂科（杭州 310009）

黄巧玲，Tel：（0571）86737209；E-mail：HQL6512@163.com